Expresión recombinante del autoantígeno ZnT8 y su aplicación en la detección y caracterización de anticuerpos en distintas formas de Diabetes Mellitus Autoinmune.

Fil: Faccinetti, Natalia Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Faccinetti, Natalia Inés
Otros Autores:	Valdez, Silvina N.
Formato:	Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Facultad de Farmacia y Bioquímica 2018
Materias:	ZnT8 Diabetes Mellitus Autoinmunidad Inmunoensayos Ciencias de la vida
Acceso en línea:	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_5772 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_5772.dir/5772.PDF
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Asimismo, dado que el ZnT8 es un\nantígeno estructural de la célula ? pancreática, la presencia de ZnT8A revela indirectamente un daño\ncelular específico.\nEl estudio de los marcadores humorales resulta interesante para investigar las bases etiopatogénicas,\ny permiten distinguir las formas de DM asociadas a autoinmunidad. El diagnóstico preciso y la terapia\nadecuada y oportuna son elementos críticos para lograr un buen control metabólico evitando la\naparición de complicaciones de la enfermedad. Los métodos radiométricos de referencia utilizados\npara la detección de los marcadores humorales de DM son ensayos de alta sensibilidad y\nespecificidad, pero presentan altos costos, requieren de material radiactivo que generan residuos\naltamente contaminantes del medioambiente y su ejecución se limita a centros de investigación\nbásica y aplicada que cuenten con la infraestructura y habilitación necesaria. Por lo tanto, es\nimprescindible el desarrollo de nuevas generaciones de ensayos no radiométricos de menor costo y\ncomplejidad operativa, que permitan mayor aplicación en laboratorios de mediana/baja complejidad\ny faciliten el acceso diagnóstico a un mayor número de pacientes, permitiendo implementar el\ntratamiento adecuado.\nEn este contexto, los objetivos generales del presente trabajo de Tesis fueron:\n-Básicos: detección y caracterización de los ZnT8A provenientes de muestras de pacientes con\ndistintos fenotipos clínicos de DM. El propósito final fue definir el perfil diferencial de\ninmunorreactividades (mapeo de epitopes) de los ZnT8A frente a distintas variantes antigénicas\nrecombinantes producidas in vitro y los parámetros termodinámicos de interacción primaria\n(concentración -q- y constante de afinidad -Ka-).\n-Aplicados: desarrollo e implementación de inmunoensayos de alta sensibilidad y baja complejidad\noperativa para el screening rutinario del marcador ZnT8A.\nEn la primera etapa se estudió la prevalencia de ZnT8A, en comparación con los otros marcadores de\nDM autoinmune -IAA/PAA, GADA e IA-2A- en tres grupos de pacientes con distintos fenotipos clínicos\nde DM. A partir de los resultados obtenidos, se demostró que ZnT8A constituye un marcador\nhumoral adicional a la tríada ya existente, incrementando la sensibilidad diagnóstica de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los\nautoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región\nen la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar\nsubpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes\nantigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La\nconstrucción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó\nla mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador\nZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados.\nA partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de\ninmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno\nrecombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la\nconstrucción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de\nsíntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los\ncuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos\nestudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un\nmayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma.\nContando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta\ninmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con\nsueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar\nlas muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1\npresentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino\netiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad.\nPosteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la\ndeterminación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo\ndoble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o\nmicroesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos\npresentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening\nrutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando\nmicroesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también\nun mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método\nalternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la\nmedición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune\nempleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro\nde Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los\nautoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región\nen la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar\nsubpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes\nantigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La\nconstrucción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó\nla mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador\nZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados.\nA partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de\ninmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno\nrecombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la\nconstrucción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de\nsíntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los\ncuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos\nestudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un\nmayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma.\nContando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta\ninmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con\nsueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar\nlas muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1\npresentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino\netiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad.\nPosteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la\ndeterminación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo\ndoble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o\nmicroesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos\npresentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening\nrutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando\nmicroesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también\nun mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método\nalternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la\nmedición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune\nempleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro\nde Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los\nautoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región\nen la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar\nsubpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes\nantigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La\nconstrucción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó\nla mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador\nZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados.\nA partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de\ninmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno\nrecombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la\nconstrucción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de\nsíntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los\ncuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos\nestudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un\nmayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma.\nContando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta\ninmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con\nsueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar\nlas muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1\npresentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino\netiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad.\nPosteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la\ndeterminación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo\ndoble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o\nmicroesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos\npresentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening\nrutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando\nmicroesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también\nun mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método\nalternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la\nmedición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune\nempleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro\nde Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas deautoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los\nautoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región\nen la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar\nsubpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes\nantigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La\nconstrucción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó\nla mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador\nZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados.\nA partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de\ninmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno\nrecombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la\nconstrucción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de\nsíntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los\ncuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos\nestudios de unión a ZnT8A. Dado que la proteína obtenida de cuerpos de inclusión presentó un\nmayor grado de pureza y un mejor rendimiento se decidió seguir trabajando con la misma.\nContando con el autoantígeno recombinante TrxZnT8 y con el objetivo de caracterizar la respuesta\ninmune humoral especifica de ZnT8A en términos de q y Ka, se realizaron radioinmunoensayos con\nsueros de pacientes con DM tipo 1 y pacientes diabéticos diagnosticados en edad adulta. Al evaluar\nlas muestras de ambos grupos, se observó que los pacientes infanto-juveniles con DM tipo 1\npresentaron menores q y mayores Ka de ZnT8A que los adultos, sugiriendo la existencia de un camino\netiopatogénico distinto entre ambos fenotipos clínicos de la enfermedad.\nPosteriormente se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase sólida para la\ndeterminación de ZnT8A. Así se desarrollaron dos métodos en fase sólida basados en el modelo\ndoble paratope: dp-piELISA y FloCMIA, con diferencias en la fase sólida empleada (microplaca o\nmicroesferas) y en el sistema de detección (colorimétrico o fluorométrico). Ambos ensayos\npresentaron parámetros analíticos adecuados para ser considerados como métodos para el screening\nrutinario de ZnT8A. Dado que el inmunoensayo basado en Citometría de Flujo empleando\nmicroesferas de poliestireno presentó una muy buena especificidad y sensibilidad, así como también\nun mayor rango dinámico que los ensayos de tipo ELISA, puede considerarse como un método\nalternativo candidato para reemplazar al RBA. Asimismo, se destaca su potencial aplicación en la\nmedición simultánea y discriminativa de varios marcadores relacionados con DM autoinmune\nempleando microesferas de distintos tamaños o fluorescencia interna (diferenciables en el Citómetro\nde Flujo) adsorbidas con distintos autoantígenos. De esta manera, las metodologías desarrolladas de autoinmunidad. El principal epitope de ZnT8 involucrado en el reconocimiento de los\nautoanticuerpos se localiza en el dominio C-terminal de la molécula (aminoácidos 268-369), región\nen la que existen dos variantes polimórficas en el residuo 325. Así, se lograron diferenciar\nsubpoblaciones de autoanticuerpos según sus inmunorreactividades frente a diferentes variantes\nantigénicas de ZnT8, alcanzando una caracterización inmunoquímica más exhaustiva de los ZnT8A. La\nconstrucción heterodimércia del dominio C-terminal de ZnT8 fue la variante antigénica que presentó\nla mejor combinación de sensibilidad y especificidad a los fines del screening rutinario del marcador\nZnT8A en los distintos grupos de pacientes estudiados.\nA partir de los resultados obtenidos en la primera etapa y teniendo en cuenta que el desarrollo de\ninmunoensayos no radiométricos para la detección de ZnT8A requería del autoantígeno\nrecombinante en grandes cantidades a un costo razonable, se procedió a la expresión de la\nconstrucción heterodimérica de ZnT8 en E. coli cepas GI698 y GI724, empleando la estrategia de\nsíntesis acoplada a Trx. La quimera TrxZnT8 se recuperó de la fracción intracelular soluble y de los\ncuerpos de inclusión con un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos\nestudios de unión a ZnT8A. 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De esta manera, las metodologías desarrolladas de menor complejidad operativa respecto del método radiométrico de referencia estimulan la\ndescentralización de las determinaciones de ZnT8A, ampliando el acceso diagnóstico a un número\nmayor de pacientes. application/pdf Cerrone, Gloria Edith Miranda, María Victoria Costa Gil, José Esteban ZnT8 Diabetes Mellitus Autoinmunidad Inmunoensayos spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Expresión recombinante del autoantígeno ZnT8 y su aplicación en la detección y caracterización de anticuerpos en distintas formas de Diabetes Mellitus Autoinmune. info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_5772 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_5772.dir/5772.PDF

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