Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo

Fil: Gurevich Messina, Juan Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

Guardado en:

Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Gurevich Messina, Juan Manuel
Otros Autores:	Camperi, Silvia Andrea
Formato:	Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Facultad de Farmacia y Bioquímica 2017
Materias:	Hormona folículo estimulante Purificación rhFSH Proteínas terapéuticas Ciencia de la vida
Acceso en línea:	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_2798 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_2798.dir/2798.PDF
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

id	I28-R145-HWA_2798
record_format	dspace
institution	Universidad de Buenos Aires
institution_str	I-28
repository_str	R-145
collection	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA)
language	Español
orig_language_str_mv	spa
topic	Hormona folículo estimulante Purificación rhFSH Proteínas terapéuticas Ciencia de la vida
spellingShingle	Hormona folículo estimulante Purificación rhFSH Proteínas terapéuticas Ciencia de la vida Gurevich Messina, Juan Manuel Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
topic_facet	Hormona folículo estimulante Purificación rhFSH Proteínas terapéuticas Ciencia de la vida
description	Fil: Gurevich Messina, Juan Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
author2	Camperi, Silvia Andrea
author_facet	Camperi, Silvia Andrea Gurevich Messina, Juan Manuel
format	Tesis doctoral Tesis doctoral acceptedVersion
author	Gurevich Messina, Juan Manuel
author_sort	Gurevich Messina, Juan Manuel
title	Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
title_short	Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
title_full	Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
title_fullStr	Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
title_full_unstemmed	Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo
title_sort	purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhfsh) por ligandos de afinidad de bajo costo
publisher	Facultad de Farmacia y Bioquímica
publishDate	2017
url	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_2798 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_2798.dir/2798.PDF
work_keys_str_mv	AT gurevichmessinajuanmanuel purificaciondelahormonafoliculoestimulanterecombinantehumanarhfshporligandosdeafinidaddebajocosto
_version_	1766017513341059072
spelling	I28-R145-HWA_27982019-09-25 Fil: Gurevich Messina, Juan Manuel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina Facultad de Farmacia y Bioquímica Camperi, Silvia Andrea Gurevich Messina, Juan Manuel 2017-03-23 Debido a su mayor robustez entre lotes, a una mayor bioseguridad y a su mejor eficacia, la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) es hoy el principal medicamento para los tratamientos de infertilidad, ganándole cada vez más terreno a la hormona folículo estimulante urinaria (uhFSH). Como su administración es parenteral su pureza debe superar el 99 % y es por lo tanto la purificación el paso crítico en su proceso de producción, representando entre el 50-80% del costo total de su producción.\nEn los procesos actuales de purificación se utilizan protocolos basados en varios pasos cromatográficos para alcanzar la pureza deseada. Éstos adolecen del problema que en cada etapa hay una pérdida de producto asociada, con la consecuente disminución de rendimiento y aumento del costo.\nLa cromatografía de afinidad (AC) es ideal para purificar biofármacos. Su elevada selectividad minimiza la contaminación y rinde muestras con alta pureza en un solo paso. Para obtener una purificación exitosa por AC es necesario contar con ligandos adecuados en cuanto a selectividad y afinidad. Si bien los anticuerpos monoclonales (mAbs) son ligandos de alta afinidad y especificidad y actualmente utilizados para purificar rhFSH, su elevado costo dificulta el escalado a nivel industrial.\nPor otro lado, los péptidos cortos son ideales como ligandos para separaciones industriales por AC ya que pueden ser sintetizados a un costo muy inferior a los mAbs en forma aséptica bajo normas GMP y son mucho más estables porque no requieren de una estructura terciaria específica para mantener su actividad biológica. Las interacciones entre los péptidos y las proteínas son generalmente moderadas, lo que resulta en condiciones suaves de elución. Los péptidos pueden modificarse químicamente en forma sencilla para mejorar su estabilidad frente a proteasas comúnmente presentes en los caldos de cultivo de manera de obtener ligandos adecuados en cuanto a estabilidad, afinidad y selectividad.\nEl desarrollo de bibliotecas combinatorias peptídicas permite ensayar millones de péptidos en forma empírica, lo que facilita enormemente el descubrimiento de ligandos adecuados para cualquier proteína de interés.\nCon el objetivo de abaratar los costos de los procesos de purificación actuales, en el presente trabajo de tesis se diseñaron péptidos cortos con afinidad por la rhFSH para ser utilizados como ligandos de afinidad de AC.\nPara ello se sintetizaron bibliotecas combinatorias peptídicas por síntesis en fase sólida, desarrollada por Merrifield, y utilizando el método dividir-acoplar-recombinar (DAR). Éste consiste en: a) dividir el soporte sólido en porciones iguales equivalentes al número de aminoácidos que se utilizarán en la construcción de la biblioteca, b) acoplar en cada porción un aminoácido diferente; c) combinar las porciones y luego volver a dividir la resina para el siguiente acople. Esto asegura que todos los péptidos de la biblioteca estén presentes en igual proporción y que cada bolilla de resina tenga una única entidad peptídica. Esta disposición facilita el screening en fase sólida. Este último consistió en colocar alícuotas de la biblioteca combinatoria peptídica en contacto con la rhFSH marcada con un colorante fluorescente o alguna marca que permita visualizar aquellas bolillas donde se haya adsorbido la rhFSH. Se aislaron las bolillas positivas, se separó el péptido de cada bolilla de resina y se secuenció por espectrometría de masas en tándem. Además de aquellos ligandos provenientes de los screenings también se probaron ligandos de afinidad para la FSH descriptos en bibliografía.\nSe trabajó con varias bibliotecas lineales, pero para mejorar la afinidad y selectividad de los ligandos obtenidos se decidió poner a punto la síntesis de bibliotecas cíclicas combinatorias. Los péptidos cíclicos por su mayor rigidez estructural en comparación con sus contrapartes lineales presentan mayor afinidad, selectividad y estabilidad frente a la degradación enzimática. El screening de las bibliotecas cíclicas es similar al de las lineales pero los péptidos cíclicos no se pueden secuenciar por Edman y su secuenciación por espectrometría de masas es muy engorrosa. Por lo tanto se plantearon dos estrategias de síntesis para facilitar la posterior secuenciación de los péptidos seleccionados durante el screening: a) la síntesis de bibliotecas de cada péptido cíclico junto con su contraparte lineal que es utilizada como código para su identificación; b) la síntesis de bibliotecas cíclicas con un sitio de apertura que permite abrir el anillo previo a su identificación por espectrometría de masas.\nSe sintetizaron matrices de afinidad con los ligandos peptídicos seleccionados. Se testearon las matrices sintetizadas con la rhFSH y con contaminantes del medio de cultivo de células CHO, provista por Zelltek S. A., empresa biotecnológica productora de un biosimilar de rhFSH. Aquella matriz con mejor resultado se usó para desarrollar un proceso de purificación de rhFSH. Se evaluaron las fracciones de lavado y eluído donde se recuperó la rhFSH y se determinó la capacidad dinámica de adsorción de rhFSH de la matriz cromatográfica desarrollada.\nSe hicieron ensayos para comprobar la biosimilaridad de la rhFSH purificada por el método desarrollado y se lo comparó con el producto purificado por Zelltek y con el producto de referencia (Gonal-F). Se evaluó el porcentaje de isoformas, el porcentaje de subunidades libres, la oxidación de la rhFSH y el contenido de ácido siálico. Los resultados fueron comparados con los valores de la Farmacopea Europea.\nLos resultados obtenidos fueron comparables a los obtenidos por el método actualmente utilizado por Zelltek, pero de menor costo, lo que hace auspiciosa la transferencia de la tecnología para abaratar costos en la purificación de la rhFSH. application/pdf Biscoglio, Mirtha Calvo, Juan Carlos Aguirre, José Manuel Hormona folículo estimulante Purificación rhFSH Proteínas terapéuticas spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencia de la vida Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_2798 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_2798.dir/2798.PDF

Purificación de la hormona folículo estimulante recombinante humana (rhFSH) por ligandos de afinidad de bajo costo

Ejemplares similares