Influencia del entorno lipídico sobre la actividad biológica de la bomba de calcio de membrana plasmática

Fil: Pignataro, María Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Pignataro, María Florencia
Otros Autores: Mangialavori, Irene
Formato: Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Facultad de Farmacia y Bioquímica 2017
Materias:
PMCA
Lípidos
Actividad enzimática
Ciencia de la vida
Acceso en línea:http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_1771
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Aporte de:
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spelling I28-R145-HWA_17712019-09-25 Fil: Pignataro, María Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina Mangialavori, Irene Facultad de Farmacia y Bioquímica Rossi, Juan Pablo Pignataro, María Florencia 2017-06-01 Las proteínas de membrana son esenciales para la regulación de la composición del medio celular, el potencial de membrana, el metabolismo y las vías de señalización. Por su ubicación son consideradas la puerta de ingreso a la célula y el blanco de muchas drogas, ya que más de la mitad de las moléculas terapéuticas pequeñas están dirigidas contra proteínas asociadas a la membrana. Sin embargo, existen escasas estructuras tridimensionales de dichas proteínas debido a las dificultades inherentes a su expresión, extracción, purificación y a la obtención de muestras abundantes y homogéneas que permitan su estudio cristalográfico. Dada su relevancia fisiopatológica y farmacológica, ha sido de especial interés desarrollar diferentes estrategias con el fin de obtener la información necesaria para resolver los distintos aspectos del complejo entramado entorno-estructura-función.\nLa bomba de calcio de la membrana plasmática (PMCA) pertenece a la superfamilia de las P-ATPasas; está presente en la membrana plasmática de todas las células eucariotas y es uno de los sistemas que participa en la remoción del Ca2+ citosólico transportándolo hacia el medio extracelular. A diferencia de los intercambiadores Na+/Ca2+ (NCX) y Na+/Ca2+-K+ (NCKX), que también remueven el Ca2+ citosólico, la PMCA es un sistema de alta afinidad y baja capacidad de transporte de Ca2+. La PMCA es regulada por calmodulina, fosfolípidos ácidos y ácidos grasos insaturados. Además, los fosfolípidos neutros como la fosfatidilcolina son esenciales para la actividad de la enzima.\nEn el presente trabajo de Tesis, estudiamos la dependencia de la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA con la fracción molar de fosfolípidos. Para tal fin, reconstituimos a la PMCA en micelas mixtas con diferentes proporciones de detergente/fosfatidilcolina y a su vez, diferentes largos de cadenas carbonadas de fosfatidilcolina. Los sistemas micelares mixtos se han utilizado ampliamente para el estudio de la interacción de las proteínas integrales de membrana con su entorno hidrofóbico. En particular, se ha aceptado el uso de este tipo de sistemas para el estudio de la PMCA ya que la misma preserva las características bioquímicas presentes en su entorno nativo. Hemos caracterizado la transición micela-vesícula de los diferentes sistemas de reconstitución utilizando para tal fin dos técnicas diferentes, la dispersión de luz estática (SLS) y la espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). Además determinamos los niveles de intermediarios fosforilados de la PMCA que permitieron describir funcionalmente los efectos ejercidos no sólo por la fracción molar presente en la micela mixta sino también la acción de diferentes largos de cadena carbonada. Finalmente, realizamos simulaciones de dinámica molecular de un modelo de la PMCA insertado en bicapas de 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) o 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de manera de explorar el efecto del grosor hidrofóbico del dominio transmembrana de la PMCA sobre la actividad ATPasa.\nMediante estas estrategias experimentales demostramos que los fosfolípidos neutros modulan la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA, modificando el número de recambio de la enzima en función de la composición de la micela mixta y de las características de las moléculas de fosfatidilcolina. Los cambios biofísicos asociados con la transición micela-vesícula incrementan el tiempo de permanencia de la enzima en el intermediario fosforilado, siendo este paso el responsable de la disminución de la actividad enzimática. Las simulaciones de dinámica molecular permitieron demostrar que cuando la PMCA se encuentra inserta en bicapas de DOPC, existen residuos cargados incluidos en el centro hidrofóbico de dichas bicapas. De manera complementaria, en las bicapas de DMPC los requerimientos de la superficie proteica se satisfacen evitando el costo termodinámico de exponer residuos cargados en zonas hidrofóbicas. De acuerdo a los datos experimentales, sugerimos que el grosor hidrofóbico óptimo para la PMCA es cercano a 24 Å, en concordancia con la máxima actividad hallada en presencia de este fosfolípido de 14 átomos de carbono de su cadena hidrofóbica.\nPara estudiar la modulación de la PMCA por ácidos grasos insaturados, se desarrolló un análogo fotoactivable de ácido oleico (AS86). Esta molécula se une covalentemente a la PMCA y es desplazable por ácido oleico. En la presente tesis hemos sintetizado, purificado y caracterizado dicho análogo y comprobamos que el AS86 se comporta de manera análoga al ácido oleico, cuando interactúa medianteunión no-covalente, incrementando la actividad Ca2+-ATPasa de la PMCA en el rango de concentraciones en las que actúa el ácido oleico. En este mismo sentido, pudimos demostrar que el AS86 es capaz de interaccionar directamente con PMCA e inducir un cambio conformacional tal que sus segmentos transmembrana se encuentran menos expuestos al entorno lipídico. Esta última característica es compartida por todos los activadores de la PMCA estudiados, incluyendo el ácido oleico. Estas evidencias demuestran la gran similitud entre la sonda fotoactivable AS86 y el ácido oleico. A partir de allí, desarrollamos una estrategia experimental que involucra la fotomarcación de la PMCA con AS86 y un posterior análisis por espectrometría de masa de los fragmentos para hallar los posibles sitios de interacción de la enzima con los ácidos grasos insaturados. La estrategia adoptada se basó en unir covalentemente el AS86 a la PMCA, realizar la digestión del aducto con V8 proteasa, separar por SDS-PAGE los fragmentos y posteriormente digerir in-gel con tripsina y luego analizar los péptidos resultantes por espectrometría de masa. Los resultados aquí mostrados constituyen la primera evidencia de un análisis mediante MALDI TOF-TOF de fragmentos trípticos de la PMCA purificada de eritrocitos humanos. Proponemos una región para la interacción del AS86 con la PMCA (E812ASDIILTDDNFTSIVKAVMW832) que podría ser parte de un dominio donde interactúan varias moléculas de ácidos grasos para el transporte de calcio.\nEn conclusión, en el presente trabajo hemos estudiado la regulación del transporte de calcio por fosfolípidos neutros y por ácidos grasos insaturados mediante el desarrollo de diferentes estrategias experimentales. Además hemos modelado la acción de estos lípidos sobre la estructura y la función de la PMCA. application/pdf Sterin de Speziale, Norma Amodeo, Gabriela Kotsias, Basilio Arístides PMCA Lípidos Actividad enzimática spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencia de la vida Influencia del entorno lipídico sobre la actividad biológica de la bomba de calcio de membrana plasmática info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_1771 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_1771.dir/1771.PDF

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