Estudio de la regulación fisiológica y de la participación de vinculina en el mantenimiento de las estructuras de adhesión celular en los túbulos colectores de la papila renal

Fil: Brandán, Yamila Romina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Brandán, Yamila Romina
Otros Autores: Dominici, Fernando Pablo
Formato: Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Facultad de Farmacia y Bioquímica 2017
Materias:
Papila renal
Túbulo colector
Uniones adherentes
Contactos focales
Ciencia de la vida
Acceso en línea:http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_1424
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spelling I28-R145-HWA_14242019-09-25 Fil: Brandán, Yamila Romina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina Dominici, Fernando Pablo Facultad de Farmacia y Bioquímica Márquez, María Gabriela Brandán, Yamila Romina 2017-03-01 Los túbulos colectores (TC) renales están formados por un epitelio simple, y su organización tisular y función requieren de la presencia de estructuras de adhesión celular, como son los contactos focales (CF) y las uniones adherentes (UA), que conectan el citoesqueleto de actina con la matriz extracelular, o con los complejos de unión célula-célula, respectivamente. Esta conexión se establece básicamente debido a la presencia de vinculina, molécula que posee sitios de unión a lípidos de membrana, a actina y a proteínas que forman parte de ambas estructuras de adhesión celular. En trabajos previos realizados con células de TC de papila renal, se demostró que la hormona bradiquinina (BK) provoca una reestructuración reversible de los CF, induciendo la movilización de vinculina, con la aparición simultánea en el citosol de vesículas conteniendo esta proteína. Estos trabajos pioneros sirvieron de base para la realización del presente trabajo de tesis.\nSe eligió como modelo de estudio cultivos primarios de células de TC de papila renal de ratas adultas. Se observó que estas células conservan in vitro las características típicas de las células de TC en el tejido intacto. Este comportamiento se vio reflejado por el crecimiento en monocapas, la expresión de los glicoconjugados (DBA+) característicos de este tipo celular, filamentos intermedios constituidos por citoqueratina-7, la formación de UA y el desarrollo de un cilio primario.\nEn la primera parte de la tesis se realizaron estudios bioquímicos y morfológicos de las vesículas que contienen vinculina. Para ello, se utilizaron muestras enriquecidas en vesículas obtenidas de cortes delgados de papila renal, estimulados con BK. Para el aislamiento de las vesículas se puso en práctica un método inmunomagnético, utilizando un anticuerpo dirigido contra vinculina. Se demostró que la vinculina se asocia de forma periférica a la membrana de las vesículas, orientada hacia el citosol, a través de interacciones electrostáticas. El análisis por Western Blot y espectrometría de masa demostró que contienen, además de vinculina, PI(4,5)P2, componentes del retículo endoplasmático (RE) y del citoesqueleto, y marcadores del compartimiento endosomal de reciclaje (Rab 5, Rab 11 y el receptor de transferrina), poniendo en evidencia la heterogeneidad de las mismas. Sobre la base de los resultados obtenidos, se propuso un modelo dinámico de distribución intracelular de vinculina. Es sabido que cuando no forma parte de las estructuras de adhesión, la vinculina conforma un pool citosólico. Los resultados obtenidos demostraron que, además de una forma libre, la vinculina también presenta una forma asociada a vesículas. Se planteó la existencia de dos poblaciones de vesículas: una localizada muy cerca del núcleo cuya función sería de reservorio, denominada circuito de tránsito restringido de vesículas entre el RE y el aparato de Golgi; y otra localizada en la zona marginal de la célula, que representa un circuito corto de reciclaje de endosomas\ntempranos, los que participarían del recambio basal de la vinculina asociada a los CF. Cuando se estimulan las células con BK, ocurren dos fenómenos. Por un lado, vinculina se disipa de los CF, la que es captada por las vesículas Rab 5+ preexistentes, que forman parte del circuito corto de reciclaje localizado en la región marginal, y a tiempos prolongados de estimulación, estas vesículas adquieren Rab 11. Esto indica que la estimulación con BK promueve una movilización de vesículas del reservorio, desde el aparato de Golgi hacia la membrana plasmática, para lograr reestablecer las condiciones basales. Además, se demostró que los microtúbulos participan en el transporte de las vesículas que contienen vinculina. Por lo tanto, BK induce una reestructuración reversible de los CF y no su desarmado.\nTrabajos previos demostraron que las proteínas que forman parte de los CF y UA, entre ellas vinculina, se localizan en microdominios rafts enriquecidos en colesterol y esfingomielina (SM). En la segunda parte de la tesis se estudió la participación de vinculina en el mantenimiento de las estructuras de adhesión celular. Para ello, las células de TC fueron incubadas en presencia de un inhibidor farmacológico, o transfectadas con un ARN de interferencia específico para las enzimas SM sintasa 1 y 2, presentes en el aparato de Golgi y membrana plasmática respectivamente, con el objetivo de disminuir su expresión. Solo la inhibición de la SM sintasa 1 produjo un deterioro de las UA, provocando la pérdida de unión entre las células. Paralelamente, se observó un incremento de la cantidad de CF que contenía vinculina, pero no talina. Puesto que la SM sintasa 1 se localiza en el aparato de Golgi, y su actividad es esencial para la formación de vesículas, el deterioro observado sobre las UA podría deberse a modificaciones en la formación de vesículas que participan en el proceso de transporte y reciclado de los complejos adherentes. Mientras que el aumento de los CF cumpliría un mecanismo compensatorio de las células ante la disolución de las uniones intercelulares, con el fin de mantenerse adheridas a la matriz extracelular, y de esta forma asegurar su supervivencia.\nEn conclusión, los resultados presentados en este trabajo de tesis doctoral aportan nuevas evidencias experimentales que resaltan la participación de la molécula de vinculina en los mecanismos que regulan la plasticidad celular, como lo es la pérdida o mantenimiento de estructuras de adhesión, para responder a cambios que se producen en su entorno sin perder la viabilidad application/pdf Galleano, Mónica López Costa, Juan José García, Margarita María Papila renal Túbulo colector Uniones adherentes Contactos focales spa Universidad de Buenos Aires. 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