Toxicidad de cianotoxinas presentes en cuerpos de agua dulce de Norpatagonia en la trucha arcoíris, Oncorhynchus mykiss

Las poblaciones de microalgas, dinoflagelados y cianobacterias pueden crecer de forma masiva en eventos conocidos como “floraciones”. Algunos de estos microorganismos pueden producir compuestos tóxicos para la biota acuática y la salud humana, e.g. algunas cianobacterias producen cianotoxinas. En...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Painefilú, Julio César
Otros Autores: Luquet, Carlos Marcelo
Formato: TesisdePostgrado doctoralThesis acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional del Comahue. Centro Regional Universitario Bariloche 2020
Materias:
Oncorhynchus mykiss
Cianobacterias
Cianotoxinas
Agua dulce
Truchas arcoiris
Ciencias de la Tierra y Medio Ambiente
Acceso en línea:http://rdi.uncoma.edu.ar/handle/uncomaid/16181
Aporte de:
Repositorio Institucional UNCo de Universidad Nacional del Comahue
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description Las poblaciones de microalgas, dinoflagelados y cianobacterias pueden crecer de forma masiva en eventos conocidos como “floraciones”. Algunos de estos microorganismos pueden producir compuestos tóxicos para la biota acuática y la salud humana, e.g. algunas cianobacterias producen cianotoxinas. En Norpatagonia, están presentes especies de varios géneros de cianobacterias y son muy frecuentes las floraciones de distintas especies del género Dolichospermum, potencial productor de más de un tipo de toxina, e.g. microcistinas (MC) como microcistina-LR (MCLR), y neurotoxinas como la saxitoxina (STX), la toxina más estudiada de un conjunto de análogos estructurales denominado “toxinas paralizantes de moluscos” (PST, por su nombre en inglés). En estos ambientes, se plantea un escenario donde la interacción entre las toxinas puede potenciar sus efectos nocivos individuales. Los peces pueden incorporar las cianotoxinas a través del intestino, acumularlas y/o excretarlas hacia el medio externo. La MCLR es absorbida en el intestino por transportadores de sales biliares (OATP) y tiene como efecto tóxico característico a la inhibición de la actividad de las enzimas proteína fosfatasa 1 y 2A (PP1 y PP2A). Puede ser transportada fuera del organismo por los transportadores dependientes de ATP, e.g. ABCC (del sistema de resistencia a múltiples xenobióticos, MXR), previa conjugación con glutatión (GSH), catalizada por la enzima glutatión S-transferasa (GST). Por otro lado, las PST típicamente inhiben los canales de sodio, y posiblemente de otros cationes, dependientes de voltaje, e interrumpen la transmisión del impulso nervioso. Sin embargo, su absorción y eliminación en el intestino, así como sus posibles efectos intracelulares, están muy poco estudiados. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el presente trabajo de tesis tiene como objetivo general profundizar el conocimiento sobre la toxicidad de MCLR y PST, en forma individual y combinada, en el intestino medio de la trucha arcoíris, Oncorhynchus mykiss. Este objetivo se llevó a cabo utilizando modelos de exposición in vivo, ex vivo (epitelio aislado, tiras y segmentos intestinales) e in vitro (enterocitos aislados y homogenatos de tejido). En los modelos ex vivo, se estimó la actividad de las enzimas PP1, GST, glutatión reductasa (GR) y catalasa (CAT), la peroxidación lipídica y el contenido de GSH y glutatión total. En los modelos in vitro, se analizó la producción de ROS y la integridad de la membrana lisosomal. Esto último se estimó a partir del tiempo de retención de rojo neutro del 50% de las células observadas (NRRT50). La actividad de los transportadores ABCC se estimó a través de la tasa de transporte de 2,4-dinitro-S-glutatión (DNP-SG), un sustrato específico, producto de la conjugación (catalizada por GST) del 1-cloro- 2,4-dinitrobenceno (CDNB) con GSH. La primera hipótesis de esta tesis plantea que las PST son absorbidas por los enterocitos del intestino medio, donde producen diversos efectos citotóxicos y son exportadas fuera de estas células por transportadores ABCC. Para poner a prueba esta hipótesis, se midió el contenido de GSH, la actividad GST, GR y CAT, y la peroxidación lipídica, la producción de ROS y el NRRT50. El transporte de DNPSG se estimó en epitelio aislado y en segmentos intestinales evertidos y sin evertir. Los resultados obtenidos sustentan parcialmente esta hipótesis. Luego de la exposición a PST se observaron indicios leves de estrés oxidativo y citotoxicidad, evidenciados por la diminución del contenido de GSH, el aumento de la actividad GST y GR y la disminución del transporte de DNP-SG (sólo en la cara basolateral del intestino) y del NRRT50. Esto último no se agravó cuando los enterocitos se expusieron a PST + MK571, un inhibidor específico de los ABCC. Este resultado sugiere que las PST no son sustratos de estos transportadores, pero sí afectan su función, particularmente en la membrana basolateral. La actividad CAT, la peroxidación lipídica y la producción de ROS no fueron alteradas por la exposición a PST. La segunda hipótesis plantea que la MCLR modula la actividad y la expresión génica de proteínas del sistema MXR en el intestino medio de O. mykiss, modificando así sus efectos citotóxicos a lo largo del tiempo. Para poner a prueba esta hipótesis, se expusieron peces in vivo durante 12, 24 y 48 h mediante alimento embebido en MCLR. Se midió el contenido de GSH y glutatión total, la actividad de GST, GR y PP1, el transporte de DNP-SG y el NRRT50. Esta información se complementó con el análisis de la expresión de ARNm de ABCC2, GST-π, GST-ω y de los factores de transcripción/receptores nucleares Nrf2, AhR, ARNT y LXR, vinculados a la activación de la expresión del ARNm de proteínas del sistema MXR VIII y de enzimas antioxidantes y detoxificantes. Los resultados apoyan parcialmente esta hipótesis. La exposición a MCLR aumentó la capacidad detoxificante del intestino a lo largo del tiempo (caracterizado por mayor actividad de GST y de transporte por ABCC), pero la inhibición de PP1 y el daño a lisosomas se mantuvieron constantes. Las modulaciones observadas no se correspondieron con cambios en la expresión de ARNm de GST-π, GST-ω, ABCC2, Nrf2, AhR, ARNT ni LXR. Según los resultados observados, es posible plantear que, mientras está presente en la dieta, la exposición a MCLR provoca una situación de estrés constante en el intestino medio de O. mykiss, pese a que el aumento de la capacidad detoxificante aumentaría la excreción de MCLR hacia afuera del enterocito. La tercer hipótesis plantea que la exposición a MCLR sensibiliza el intestino medio de O. mykiss frente a la toxicidad de las PST. Para poner a prueba esta hipótesis, se realizaron exposiciones consecutivas a MCLR in vivo y, luego, a PST ex vivo. Se midió el contenido de GSH y glutatión total, la actividad GST, GR, PP1 y CAT, el NRRT50, la producción de ROS y el transporte de DNP-SG (en segmentos intestinales evertidos y sin evertir). Los resultados obtenidos apoyan parcialmente esta hipótesis, ya que la interacción de MCLR y PST produjo efectos negativos sobre el balance oxidativo en el epitelio intestinal, que no se manifestaron en la exposición a cada cianotoxina por separado. La exposición consecutiva a MCLR in vivo y PST ex vivo provocó la disminución en el contenido de GSH y en el cociente GSH/GSSG. Este efecto se correspondió con la disminución de la actividad GST, el aumento de la actividad CAT y la mayor producción de ROS. Por otro lado, la inhibición de la actividad PP1 por parte de MCLR no se agravó en presencia de PST. Por último, el pretratamiento con MCLR previno la inhibición de la actividad de los ABCC basolaterales producida por PST. Este trabajo de tesis permite concluir que el intestino medio de Oncorhynchus mykiss es un órgano sensible a la exposición a MCLR y PST. Estas toxinas ingresan a los enterocitos y afectan sus funciones, tanto en forma individual como combinada. Los efectos citotóxicos y de estrés oxidativo, producidos por ambas toxinas persisten aun cuando la actividad del sistema MXR está aumentada, y sus efectos combinados configuran un escenario muy complejo que amerita el desarrollo de nuevos estudios.

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