Detección de antiparasitarios químicos en estiércol compostado equino y mejoramiento de la producción de una alternativa biológica de control antiparasitario
El control de las endoparasitosis se encuentra comprometido debido al uso indiscriminado de drogas antiparasitarias, las cuales generaron altos grados de resistencia. Además, se presenta otro problema relacionado a la ecotoxicidad de las mismas. Aquellas drogas que son eliminadas mediante las heces...
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| Publicado: |
Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas.
2024
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| Acceso en línea: | Junco, M. (2024). Detección de antiparasitarios químicos en estiércol compostado equino y mejoramiento de la producción de una alternativa biológica de control antiparasitario [Tesis de doctorado]. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. |
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El control de las endoparasitosis se encuentra comprometido debido al uso indiscriminado de drogas antiparasitarias, las cuales generaron altos grados de resistencia. Además, se presenta otro problema relacionado a la ecotoxicidad de las mismas. Aquellas drogas que son eliminadas mediante las heces de los animales, generan desórdenes sobre la biodiversidad de organismos coprófilos. Su pasaje sea desde el suelo o desde el mismo enmendado con estiércol hacia las plantas ya ha sido probado. Por este motivo, se debe mejorar la perspectiva del control biológico (CB) como alternativa a los problemas de resistencia siendo, además, capaz de atender las necesidades de una producción orgánica, sustentable y amigable con el medio. De este último ítem resulta imperiosos dilucidar si el compostaje de estiércol es una herramienta confiable para brindar un producto de calidad libre de antiparasitarios químicos.
Frente a este panorama, el CB con base en hongos nematófagos (HN) es una valiosa herramienta que no solo ofrece control antihelmíntico, sino también por su condición natural, mitigar los efectos sobre el ambiente y reducir la presencia de químicos en los alimentos. Los HN son, actualmente, la alternativa más promisoria y entre éstos, Duddingtonia flagrans. Esta especie es una de las más estudiadas a nivel mundial por su gran actividad predatoria y capacidad de resistencia al pasaje gastrointestinal proporcionada por la gruesa pared de sus clamidosporas, facilitando el desarrollo de diferentes formas de administración oral en el ganado. Es un hongo saprófito que ante la presencia de nematodos en el suelo forma redes tridimensionales para depredarlos, actuando sobre las formas pre-parasíticas de tricostróngilos en el microambiente de la materia fecal (MF) reduciendo la infectividad de las pasturas.
En este contexto, los objetivos generales del presente trabajo de Tesis fueron determinar el tiempo de permanencia de residuos de ivermectina (IVM) y huevos de parásitos intestinales en compost proveniente de MF equina y el mejoramiento de la producción de D. flagrans como una herramienta no química de control de nematodos gastrointestinales in vitro. }
En la Sección Experimental I se evaluó la presencia de la molécula de IVM en el proceso de compostaje de MF de origen equino. Se utilizó un sistema de compostaje vertical y se validó la metodología para la detección de IVM en compost, empleando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se analizaron parámetros físico químicos de calidad de compost: temperatura, relación carbono: nitrógeno (C: N), pH, conductividad eléctrica (CE), fósforo total (P) y la relación amonio: nitrato (N-NH4+/N-NO3-). A partir de muestras de compost utilizando MF equina adicionada con IVM (2000 ng/g) se realizó la detección del antiparasitario mediante HPLC durante un período experimental de 120 días. Las unidades experimentales fueron muestreadas en la superficie, medio y profundidad para lograr representatividad. Se comprobó la presencia de la molécula en los tres tambores adicionados con un incremento en los muestreos iniciales y una posterior reducción. Sin embargo, el sistema no fue capaz de degradar los residuos de IVM con la que se adicionó la MF. Adicionalmente, se evaluó el efecto del proceso en el desarrollo de huevos de nematodos gastrointestinales (NGI) a través de coprocultivos. Se hallaron huevos hasta el día 60 post inicio del ensayo tanto en los tambores control como tratados. Sin embargo, los coprocultivos de los tambores adicionados con IVM no presentaron larvas infectivas a partir del día 3 post inicio del ensayo, mientras que los tambores no adicionados, no presentaron larvas a partir del día 40 de iniciado el ensayo.
En la Sección Experimental II, se evaluó el efecto del sulfato de amonio, del acetato de sodio y del manitol sobre la producción de clamidosporas de D. flagrans, así como el efecto de la modificación de las concentraciones de los componentes del medio. A su vez, se expuso el material biológico a condiciones de cultivo adversas de temperatura y humedad con el fin de estimular la producción de estructuras de resistencia. Para realizar la cuantificación de las clamidosporas en los diferentes medios de cultivo, se sembraron placas de Petri adicionadas con las concentraciones correspondientes y expuestas a diferentes atmósferas: 40ºC/20% humedad relativa (HR), 27ºC/60% HR y 24ºC/55% HR. El sulfato de amonio y el acetato de sodio, ambos al 2%, tuvieron un efecto tóxico dado que no se produjo crecimiento micelial. En cambio, el manitol tuvo una respuesta significativa (p < 0.05) en la producción de clamidosporas. Las diferentes concentraciones evaluadas del medio de cultivo habitual arrojaron valores de p > 0.05, sin embargo, al reducir la concentración de los componentes la cantidad de clamidosporas recuperadas fue menor. En cuanto a la exposición del material biológico a condiciones adversas de temperatura y humedad, se evidenció un aumento (p < 0.05) de la producción de clamidosporas al reducir 10% la humedad relativa. Posteriormente a cada nueva condición de cultivo evaluada, se realizaron coprocultivos con larvas de NGI provenientes de terneros naturalmente parasitados, para verificar que la capacidad predatoria del hongo no había sido modificada.
Finalmente, la Sección Experimental III se orientó a estudiar dos alginatos de producción nacional para el desarrollo de una forma de administración de las clamidosporas en el agua de bebida. Se evaluaron diferentes concentraciones de este componente en sus dos versiones, para la formación de cápsulas que transporten el material biológico utilizando el método de gelificación iónica. Las concentraciones de alginato evaluadas fueron 1; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5, 2 y 3,3%. El uso del alginato Saporiti® no resultó para ninguna de las concentraciones, mientras que, el alginato Química Bolívar®, resultó para las concentraciones de 1,5 y 2%. Se determinó el tiempo de flotabilidad y estabilidad de las cápsulas, luego del agregado del material biológico. Además, se evaluó la capacidad nematófaga de D. flagrans luego del proceso de formación de las mismas. Ambos alginatos fueron analizados por calorimetría diferencial de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TGA) e infrarrojo transformado de Fourier (FTIR).
La presente tesis Doctoral ofrece una visión integral de los desafíos actuales en el control de las endoparasitosis en animales, especialmente enfocándose en el problema de resistencia inducida por el uso excesivo de drogas antiparasitarias y su impacto ambiental. Se destaca la necesidad apremiante de buscar alternativas sostenibles y efectivas y, en este contexto, el CB con HN emerge como una solución prometedora. Los hallazgos de esta investigación resaltan la importancia de comprender la persistencia de residuos de IVM en compost equino, así como explorar nuevas vías para aplicar el CB en el campo. Los experimentos realizados proporcionan valiosos conocimientos sobre la producción de clamidosporas de D. flagrans y su viabilidad en diferentes condiciones. Además, la formulación de cápsulas de alginato como vehículo de administración representa un avance significativo hacia la implementación práctica de esta estrategia. En conjunto, estos resultados contribuyen a mejorar la comprensión de cómo abordar eficazmente el problema de las endoparasitosis, promoviendo prácticas más sustentables y amigables con el medio ambiente en la producción animal. |
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Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas. |
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Por este motivo, se debe mejorar la perspectiva del control biológico (CB) como alternativa a los problemas de resistencia siendo, además, capaz de atender las necesidades de una producción orgánica, sustentable y amigable con el medio. De este último ítem resulta imperiosos dilucidar si el compostaje de estiércol es una herramienta confiable para brindar un producto de calidad libre de antiparasitarios químicos. Frente a este panorama, el CB con base en hongos nematófagos (HN) es una valiosa herramienta que no solo ofrece control antihelmíntico, sino también por su condición natural, mitigar los efectos sobre el ambiente y reducir la presencia de químicos en los alimentos. Los HN son, actualmente, la alternativa más promisoria y entre éstos, Duddingtonia flagrans. Esta especie es una de las más estudiadas a nivel mundial por su gran actividad predatoria y capacidad de resistencia al pasaje gastrointestinal proporcionada por la gruesa pared de sus clamidosporas, facilitando el desarrollo de diferentes formas de administración oral en el ganado. Es un hongo saprófito que ante la presencia de nematodos en el suelo forma redes tridimensionales para depredarlos, actuando sobre las formas pre-parasíticas de tricostróngilos en el microambiente de la materia fecal (MF) reduciendo la infectividad de las pasturas. En este contexto, los objetivos generales del presente trabajo de Tesis fueron determinar el tiempo de permanencia de residuos de ivermectina (IVM) y huevos de parásitos intestinales en compost proveniente de MF equina y el mejoramiento de la producción de D. flagrans como una herramienta no química de control de nematodos gastrointestinales in vitro. } En la Sección Experimental I se evaluó la presencia de la molécula de IVM en el proceso de compostaje de MF de origen equino. Se utilizó un sistema de compostaje vertical y se validó la metodología para la detección de IVM en compost, empleando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Se analizaron parámetros físico químicos de calidad de compost: temperatura, relación carbono: nitrógeno (C: N), pH, conductividad eléctrica (CE), fósforo total (P) y la relación amonio: nitrato (N-NH4+/N-NO3-). A partir de muestras de compost utilizando MF equina adicionada con IVM (2000 ng/g) se realizó la detección del antiparasitario mediante HPLC durante un período experimental de 120 días. Las unidades experimentales fueron muestreadas en la superficie, medio y profundidad para lograr representatividad. Se comprobó la presencia de la molécula en los tres tambores adicionados con un incremento en los muestreos iniciales y una posterior reducción. Sin embargo, el sistema no fue capaz de degradar los residuos de IVM con la que se adicionó la MF. Adicionalmente, se evaluó el efecto del proceso en el desarrollo de huevos de nematodos gastrointestinales (NGI) a través de coprocultivos. Se hallaron huevos hasta el día 60 post inicio del ensayo tanto en los tambores control como tratados. Sin embargo, los coprocultivos de los tambores adicionados con IVM no presentaron larvas infectivas a partir del día 3 post inicio del ensayo, mientras que los tambores no adicionados, no presentaron larvas a partir del día 40 de iniciado el ensayo. En la Sección Experimental II, se evaluó el efecto del sulfato de amonio, del acetato de sodio y del manitol sobre la producción de clamidosporas de D. flagrans, así como el efecto de la modificación de las concentraciones de los componentes del medio. A su vez, se expuso el material biológico a condiciones de cultivo adversas de temperatura y humedad con el fin de estimular la producción de estructuras de resistencia. Para realizar la cuantificación de las clamidosporas en los diferentes medios de cultivo, se sembraron placas de Petri adicionadas con las concentraciones correspondientes y expuestas a diferentes atmósferas: 40ºC/20% humedad relativa (HR), 27ºC/60% HR y 24ºC/55% HR. El sulfato de amonio y el acetato de sodio, ambos al 2%, tuvieron un efecto tóxico dado que no se produjo crecimiento micelial. En cambio, el manitol tuvo una respuesta significativa (p < 0.05) en la producción de clamidosporas. Las diferentes concentraciones evaluadas del medio de cultivo habitual arrojaron valores de p > 0.05, sin embargo, al reducir la concentración de los componentes la cantidad de clamidosporas recuperadas fue menor. En cuanto a la exposición del material biológico a condiciones adversas de temperatura y humedad, se evidenció un aumento (p < 0.05) de la producción de clamidosporas al reducir 10% la humedad relativa. Posteriormente a cada nueva condición de cultivo evaluada, se realizaron coprocultivos con larvas de NGI provenientes de terneros naturalmente parasitados, para verificar que la capacidad predatoria del hongo no había sido modificada. Finalmente, la Sección Experimental III se orientó a estudiar dos alginatos de producción nacional para el desarrollo de una forma de administración de las clamidosporas en el agua de bebida. Se evaluaron diferentes concentraciones de este componente en sus dos versiones, para la formación de cápsulas que transporten el material biológico utilizando el método de gelificación iónica. Las concentraciones de alginato evaluadas fueron 1; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5, 2 y 3,3%. El uso del alginato Saporiti® no resultó para ninguna de las concentraciones, mientras que, el alginato Química Bolívar®, resultó para las concentraciones de 1,5 y 2%. Se determinó el tiempo de flotabilidad y estabilidad de las cápsulas, luego del agregado del material biológico. Además, se evaluó la capacidad nematófaga de D. flagrans luego del proceso de formación de las mismas. Ambos alginatos fueron analizados por calorimetría diferencial de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TGA) e infrarrojo transformado de Fourier (FTIR). La presente tesis Doctoral ofrece una visión integral de los desafíos actuales en el control de las endoparasitosis en animales, especialmente enfocándose en el problema de resistencia inducida por el uso excesivo de drogas antiparasitarias y su impacto ambiental. Se destaca la necesidad apremiante de buscar alternativas sostenibles y efectivas y, en este contexto, el CB con HN emerge como una solución prometedora. Los hallazgos de esta investigación resaltan la importancia de comprender la persistencia de residuos de IVM en compost equino, así como explorar nuevas vías para aplicar el CB en el campo. Los experimentos realizados proporcionan valiosos conocimientos sobre la producción de clamidosporas de D. flagrans y su viabilidad en diferentes condiciones. Además, la formulación de cápsulas de alginato como vehículo de administración representa un avance significativo hacia la implementación práctica de esta estrategia. En conjunto, estos resultados contribuyen a mejorar la comprensión de cómo abordar eficazmente el problema de las endoparasitosis, promoviendo prácticas más sustentables y amigables con el medio ambiente en la producción animal. The control of endoparasitosis is compromised due to the indiscriminate use of antiparasitic drugs, which has generated high levels of resistance. Additionally, there is another problem related to their ecotoxicity. Drugs that are excreted in animal feces cause disruptions to the biodiversity of coprophilic organisms. Their passage from the soil or manure-amended soil to plants has already been proven. For this reason, the perspective of biological control (BC) needs to be improved as an alternative to resistance problems, being also capable of meeting the needs of organic, sustainable, and environmentally friendly production. From this perspective, it is imperative to determine whether composting manure is a reliable tool to provide a quality product free of chemical antiparasitics. In this context, BC based on nematophagous fungi (NF) is a valuable tool that not only offers anthelmintic control but also, due to its natural condition, mitigates environmental effects and reduces the presence of chemicals in food. Currently, NF is the most promising alternative, and among these, Duddingtonia flagrans is one of the most studied worldwide for its high predatory activity and resistance to gastrointestinal passage provided by the thick wall of its chlamydospores, facilitating the development of different forms of oral administration in livestock. It is a saprophytic fungus that forms three-dimensional networks to prey on nematodes in the soil, acting on the pre-parasitic forms of trichostrongylids in the microenvironment of fecal matter (FM), reducing the infectivity of pastures. In this context, the general objectives of this thesis were to determine the persistence time of ivermectin (IVM) residues and intestinal parasite eggs in compost derived from equine FM and to improve the production of D. flagrans as a non-chemical tool for gastrointestinal nematode control in vitro. In Experimental Section I, the presence of the IVM molecule in the composting process of equine FM was evaluated. A vertical composting system was used, and the methodology for IVM detection in compost was validated using high-performance liquid chromatography (HPLC). Physicochemical parameters of compost quality were analyzed: temperature, carbon: nitrogen ratio (C: N), pH, electrical conductivity (EC), total phosphorus (P), and the ammonium ratio (N-NH4+/N-NO3-). Using compost samples with equine FM added with IVM (2000 ng/g), the antiparasitic was detected by HPLC over an experimental period of 120 days. Experimental units were sampled at the surface, middle, and depth to achieve representativeness. The presence of the molecule was confirmed in all three drums with an increase in initial samples and a subsequent reduction. However, the system was not able to degrade the IVM residues added to the FM. Additionally, the effect of the process on the development of gastrointestinal nematode (GIN) eggs was evaluated through coprocultures. Eggs were found until day 60 post-trial start in both control and treated drums. However, coprocultures from drums added with IVM showed no infective larvae from day 3 post-trial start, while non-added drums showed no larvae from day 40 of the trial. In Experimental Section II, the effect of ammonium sulfate, sodium acetate, and mannitol on the production of D. flagrans chlamydospores was evaluated, as well as the effect of modifying the concentrations of medium components. Additionally, the biological material was exposed to adverse culture conditions of temperature and humidity to stimulate the production of resistance structures. For quantification of chlamydospores in different culture media, Petri dishes were seeded with the corresponding concentrations and exposed to different atmospheres: 40°C/20% relative humidity (RH), 27°C/60% RH, and 24°C/55% RH. Ammonium sulfate and sodium acetate, both at 2%, had a toxic effect as no mycelial growth occurred. In contrast, mannitol had a significant response (p < 0.05) in chlamydospore production. Different concentrations of the usual culture medium showed p > 0.05 values; however, reducing the concentration of components resulted in fewer recovered chlamydospores. Exposure of biological material to adverse temperature and humidity conditions showed an increase (p < 0.05) in chlamydospore production by reducing relative humidity by 10%. After each new culture condition evaluated, coprocultures with GIN larvae from naturally parasitized calves were performed to verify that the fungus's predatory capacity was not modified. Finally, Experimental Section III focused on studying two nationally produced alginates for developing a form of chlamydospore administration in drinking water. Different concentrations of this component in its two versions were evaluated for capsule formation to transport biological material using the ionic gelation method. The alginate concentrations evaluated were 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, and 3.3%. The use of Saporiti® alginate was not suitable for any concentration, while Química Bolívar® alginate was effective at concentrations of 1.5% and 2%. The floatability and stability time of the capsules were determined after adding biological material. Additionally, the nematophagous capacity of D. flagrans was evaluated after capsule formation. Both alginates were analyzed by differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetric analysis (TGA), and Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR). This doctoral thesis provides a comprehensive view of the current challenges in controlling endoparasitosis in animals, especially focusing on the problem of resistance induced by excessive use of antiparasitic drugs and their environmental impact. It highlights the urgent need to seek sustainable and effective alternatives, and in this context, BC with NF emerges as a promising solution. The findings of this research emphasize the importance of understanding the persistence of IVM residues in equine compost and exploring new ways to apply BC in the field. The experiments provide valuable insights into the production of D. flagrans chlamydospores and their viability under different conditions. Moreover, the formulation of alginate capsules as a delivery vehicle represents a significant advancement towards the practical implementation of this strategy. Altogether, these results contribute to better understanding how to effectively address the problem of endoparasitosis, promoting more sustainable and environmentally friendly practices in animal production. Fil: Junco, Milagros. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina. Fil: Iglesias, Lucía Emilia. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina. Fil: Saumell, Carlos Alfredo. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas; Argentina. 2024 info:eu-repo/date/embargoEnd/2025-05-06 2025-03-28T16:38:36Z 2025-03-28T16:38:36Z info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:eu-repo/semantics/acceptedVersion Junco, M. (2024). Detección de antiparasitarios químicos en estiércol compostado equino y mejoramiento de la producción de una alternativa biológica de control antiparasitario [Tesis de doctorado]. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires, Argentina. https://doi.org/10.52278/4359 https://www.ridaa.unicen.edu.ar/handle/123456789/4359 spa http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ info:eu-repo/semantics/embargoedAccess application/pdf application/pdf Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas. |