Estudio de la interacción de los diacilgliceroles y los dominios lipídicos con el receptor de acetilcolina nicotínico

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico activado por ligandos, presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular. Su estabilidad en la membrana celular es de suma importancia, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica, que puede ser alterada an...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Kamerbeek, Constanza Belén
Otros Autores: Barrantes, Francisco J.
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2014
Materias:
Bioquímica
Diacilglicerol
Colesterol
AChR
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/511
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es un canal iónico activado por ligandos, presente en el sistema nervioso central y en la unión neuromuscular. Su estabilidad en la membrana celular es de suma importancia, ya que determina el nivel de respuesta colinérgica, que puede ser alterada ante diversas situaciones fisiológicas y patológicas. En esta Tesis utilizamos como modelo experimental a las células CHO-K1/A5, una línea celular que expresa de forma estable al AChR muscular adulto. En el primer capítulo nos centramos en el estudio de la posible acción de los diacilgliceroles (DAG) sobre la expresión/distribución del AChR. Realizamos los experimentos con el dioctanoilglicerol (DOG), y definimos dos tiempos de tratamiento, a los que denominamos tiempos cortos (3-4 hs) y largos (18 hs) de incubación. A tiempos cortos, el DOG aumenta los niveles de AChR presentes en la superficie celular, mientras que a tiempos largos los disminuye con el concomitante aumento de los AChR intracelulares. A su vez, el incremento de los DAG endógenos como consecuencia de la alteración de diversas vías metabólicas, afecta de igual manera al AChR a tiempos cortos. Como el tratamiento con un éster de forbol, molécula análoga al DAG por su capacidad de interaccionar con los dominios C1 de diversas proteínas, resultó en los mismos cambios sobre la distribución del AChR, concluimos que los efectos del DOG eran debidos a su papel como segundo mensajero lipídico. Mediante el empleo de inhibidores enzimáticos y de anticuerpos específicos para las proteínas quinasas C (PKC) clásicas, las PKC noveles y las PKD, determinamos que los DAG a tiempos cortos de incubación favorecerían la inhibición de las PKCc al favorecer su desfosforilación, y esto disminuiría la internalización del AChR. Por otra parte, el estímulo con DOG a tiempos largos de las distintas PKC estudiadas, provocaría el efecto opuesto. El segundo capítulo se centró en el estudio de la distribución de los clústeres de AChR, generados por la unión de anticuerpos, en dominios lipídicos con diferentes valores de polarización generalizada (GP). Esta medición se realizó gracias a la tinción de las células con di-4-ANEPPDHQ, una sonda fluorescente capaz de poner en evidencia los cambios en la polaridad de la membrana, relacionados a un orden de membrana determinado. La depleción del colesterol (Col) disminuye los valores promedio de la GP de la membrana, aumentando en consecuencia la asociación de los clústeres de AChR a dominios de membrana más desordenados. Por otra parte, la despolimerización del citoesqueleto de actina con Latrunculina A, produce el efecto contrario al aumentar la asociación de los acúmulos de AChR con dominios de membrana más ordenados. Estos resultados indican que la distribución del AChR en la superficie celular depende del contenido de Col y de la integridad del citoesqueleto de actina. Por otra parte, el AChR se internaliza en pequeñas vesículas con valores bajos de la GP y bajo contenido de Col, situación que se mantiene frente a la depleción del Col producida por el tratamiento con metil-β-ciclodextrina, demostrando entonces que la endocitosis del AChR requiere de la disociación previa del receptor con dominios ricos en Col presentes en la membrana.
author2 Barrantes, Francisco J.
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Kamerbeek, Constanza Belén
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