Propiedades biofísicas de esfingomielinas y ceramidas con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena

Los esfingolípidos de las células germinales y espermatozoides de mamífero son inusuales por contener una alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena (VLCPUFA). En las gametas de rata, la esfingomielina (SM) y la ceramida (Cer) contienen especies con ácidos tetraenoicos y pe...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Peñalva, Daniel Alejandro
Otros Autores: Aveldaño, Marta Isabel
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2015
Materias:
Bioquímica
Esfingomielinas
Ceramidas
Propiedades biofísicas
Espermatozoides
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/4622
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description Los esfingolípidos de las células germinales y espermatozoides de mamífero son inusuales por contener una alta proporción de ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena (VLCPUFA). En las gametas de rata, la esfingomielina (SM) y la ceramida (Cer) contienen especies con ácidos tetraenoicos y pentaenoicos de la serie n-6 de hasta 32 carbonos, en versiones no hidroxiladas (n-V) y 2-hidroxiladas (h-V). Estudios previos habían mostrado que las SM con VLCPUFA se forman en las células espermatogénicas, que la relación entre h-V SM y n-V SM aumenta con la diferenciación celular, y que ambas terminan localizadas específicamente en las cabezas espermáticas. Posteriormente se vio que estas SM disminuyen a medida que aumentan las Cer en las gametas de rata durante reacciones que ocurren en etapas claves de la fertilización, en especial durante la reacción acrosomal. El objetivo de este trabajo fue contribuir al conocimiento de las propiedades biofísicas de estos inusuales esfingolípidos y a determinar cómo estas propiedades cambian como resultado de dichos eventos bioquímicos. Nuestro primer desafío fue obtener estas relativamente minoritarias especies moleculares en suficiente cantidad y aceptable pureza. Para ello tomamos ventaja de su estructura química. Así, fracciones conteniendo especies de n-V SM y h-V SM se separaron de las mayoritarias SM saturadas y monoenoicas teniendo en cuenta el alto número de dobles ligaduras de sus ácidos grasos. Luego, de la primera fracción se obtuvieron especies de SM con n-28:4, n-30:5 y n-32:5, y de la segunda especies con h-28:4, h-30:5 y h-32:5, aprovechando las diferencias de hidrofobicidad entre estos ácidos grasos. Estas fracciones y especies se incluyeron en sistemas modelo de bicapa y monocapa, y se estudiaron aplicando metodologías e instrumentación previamente validadas para especies de SM con 16:0, 18:1, o 24:1. Un enfoque similar se aplicó para estudiar las especies de las fracciones n-V Cer y h-V Cer. Al estudiarlas por espectroscopía de fluorescencia, tanto la polarización generalizada (GP) del Laurdan como la anisotropía de fluorescencia (r) del DPH mostraron que la mayoría de las n-V SM y h-V SM compartieron la característica de tener temperaturas de transición (Tt) muy bajas, por debajo de 5 °C, salvo n-32:5 SM y h-32:5 SM, cuyas Tt fueron cercanas a los 22 °C. El aumento en la Tt que podría esperarse debido al inusual largo de la cadena acílica, es pues contrarrestado por la presencia de varias dobles ligaduras en estos ácidos grasos. Estos estudios indicaron que las cadenas acilicas de estas especies se encuentran en un estado desordenado a temperatura fisiológica. Las h-V SM exhibieron mayores valores de GP y de r que las correspondientes especies n-V SM, indicando que el grupo hidroxilo en las primeras tiende a promover las interacciones intermoleculares, probablemente a través de la formación de uniones tipo puente hidrógeno. Las interacciones entre las SM con VLCPUFA y otros lípidos se investigaron empleando sistemas modelo multicomponente en forma de bicapa. En bicapas formadas por dimiristoíl-PC y estas SM, se concluyó que éstas últimas jugarían el rol de lípidos “fluidificantes”, en discrepancia con la noción generalmente aceptada de que en las membranas celulares las SM son las que restringen la movilidad de otros lípidos. En sistemas conteniendo dioleoil-PC, colesterol y n-V o h-V SM, ninguna de éstas tendió a segregarse en dominios condensados enriquecidos en SM/colesterol a temperatura ambiente, tal como sí lo hizo claramente la 16:0 SM. Las dos estrategias experimentales sugirieron que a temperatura fisiológica y en membranas naturales donde las SM con VLCPUFA coexisten con otros lípidos, como es el caso de la membrana plasmática de la cabeza espermática, estas especies no se concentrarían en áreas de la membrana ricas en colesterol, sino en áreas ricas en glicerofolípidos poliinsaturados, esto es, en dominios más “desordenados” de la membrana. Una valiosa información acerca de las propiedades de superficie de las SM en estudio se obtuvo de los experimentos realizados en monocapas de Langmuir. Analizando los valores de la presión de superficie (π) y el potencial de superficie (ΔV), así como los datos de la microscopía de ángulo de Brewster (BAM) en función de la compresión aplicada, se caracterizaron las interacciones intermoleculares durante el empaquetamiento de los lípidos y los cambios termodinámicos implicados en ellas. Las SM con VLCPUFA formaron films con un espesor considerablemente menor al esperado, encontrándose en un régimen líquido-expandido (LE) con una alta libertad conformacional. Sus valores de área molecular media (MMA) fueron llamativamente grandes con respecto a la de las SM conocidas, lo cual indica que un mismo número de moléculas ocupa un área significativamente mayor en la membrana. Las h-V SM mostraron menores MMA que las equivalentes n-V SM, confirmando que el grupo hidroxilo en las primeras favorece las interacciones intermoleculares, permitiendo así un mayor grado de empaquetamiento durante el proceso de compresión, lo que explica que ocupen una menor área en el plano de la membrana. Cuando se obtuvieron las isotermas a 7 °C de las seis especies de SM en estudio, sólo n-32:5 SM y h-32:5 SM mostraron transiciones de fase LE → LC (líquido condensado) de primer orden, otro hallazgo consistente con el comportamiento previamente observado en bicapa. Las seis especies moleculares mayoritarias de Cer con VLCPUFA también fueron separadas y estudiadas en monocapas de Langmuir. Las isotermas de compresión presentaron una transición de fase LE  LC de primer orden a temperatura ambiente, con segregación de dominios durante esta transición que pudo ser seguida mediante BAM. En ambos estados de fase, todas ellas mostraron valores mucho más altos de MMA y ΔV que las especies conocidas usadas como referencia. El empaquetamiento molecular y el grado de ordenamiento de las cadenas fue relativamente menor para las n-V Cer que para las h-V Cer. Estas últimas formaron membranas de mayor espesor, ocuparon una menor área de superficie, y presentaron transiciones de fase LE  LC más pronunciadas y cooperativas que las n-V Cer. Tomados en conjunto, los parámetros termodinámicos y de superficie permiten concluir que estas Cer se organizan con sus ácidos grasos en una conformación curvada, formando monocapas con un espesor menor al esperado, siendo esta característica aún más marcada en las n-V Cer que en las h-V Cer. Mientras las propiedades reológicas de la h-28:4 SM fueron similares a las de otras especies de SM, las de la h-28:4 Cer fueron atípicas. Así, la fase LC de ésta fue altamente compresible, lo que es consistente con una gran libertad conformacional de sus cadenas hidrofóbicas, pero la difusión en ella, estuvo muy restringida, presentando un coeficiente de difusión (D) 100 veces más bajo que su contraparte h-28:4 SM. Las propiedades de mezclas en que coexisten h-28:4 SM y h-28:4 Cer fueron estudiadas mediante la pre-mezcla de distintas proporciones de ambas y mediante la generación de la última por acción de una esfingomielinasa colocada en la subfase de un film de h-28:4 SM. Ambos enfoques evidenciaron que la Cer tiende a separarse de la fase fluida en que se encuentra la SM, formando dominios ricos en Cer a medida que aumenta la relación molar Cer/SM. A temperatura fisiológica, estos dominios mostraron una morfología y una organización estructural sobre la superficie del film que difirieron marcadamente de los que exhibió la 16:0 Cer. Tomadas en conjunto, las presentes observaciones podrían ser relevantes para la reorganización estructural que se sabe ocurre sobre la cabeza espermática durante la reacción acrosomal, al completarse la cual la mayor parte de las SM con VLCPUFA preexistentes se convierten en las correspondientes Cer.

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