Localización en dominios de membrana y biosíntesis de los esfingolípidos con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena de células espermatogénicas en diferenciación
El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el avance de la maduración sexual y la diferen...
| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | tesis doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2019
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Bioquímica Células germinales Lípidos Espermatogénesis Células espermatogénicas Esfingolípidos Santiago Valtierra, Florencia Ximena Localización en dominios de membrana y biosíntesis de los esfingolípidos con ácidos grasos poliinsaturados de muy larga cadena de células espermatogénicas en diferenciación |
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Aveldaño, Marta Isabel |
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El objetivo general de esta tesis fue contribuir al conocimiento de la fisiología del
sistema reproductor masculino a través del estudio de cómo esfingolípidos que son
específicos de las células espermatogénicas (o células germinales, CG) cambian con el
avance de la maduración sexual y la diferenciación celular. El foco estuvo sobre las
especies moleculares de esfingomielina (SM) y de ceramida (Cer) con ácidos grasos
poliinsaturados (PUFA) de muy larga cadena (VLCPUFA), que se presentan como
VLCPUFA no hidroxilados (n-V) y 2-hidroxilados (h-V) de hasta 32 átomos de carbono en las
CG de rata. Los objetivos específicos fueron i) investigar cómo se distribuyen estas especies
moleculares entre las membranas de las CG, ii) determinar cómo cambia con el desarrollo
testicular y la diferenciación celular la expresión de los genes que codifican a las enzimas
responsables de la biosíntesis de los n-V y los h-V, iii) establecer si las CG aisladas son
capaces de biosintetizar por sí mismas estas especies de Cer y de SM entre otras a través
de la vía de novo y de expresar las correspondientes sintasas, y iv) inquirir sobre factores
endocrinos y/o paracrinos capaces de modular dicha actividad y/o expresión.
Los efectos del desarrollo se estudiaron en testículos de animales de distintas edades
postnatales (P), y los de la diferenciación en poblaciones de CG en los estadios de
espermatocitos en paquiteno (EP), espermátidas redondas (ER), y espermátidas elongadas
o tardías (ET), aisladas a partir de las células totales (CT) del epitelio seminífero de ratas
adultas. En algunas mediciones se incluyeron a los cuerpos residuales (CR) y a las células
de Sertoli (SC). Las poblaciones de CG se aislaron utilizando gradientes continuos de
albúmina. Los estudios que requirieron separación, aislamiento e identificación de clases de
lípidos y especies moleculares se hicieron por técnicas cromatográficas de alta resolución y
sensibilidad. Las investigaciones sobre biosíntesis de n-V o de esfingolípidos (SL) se
hicieron en CG mantenidas en cultivo primario, siguiendo las transformaciones biológicas de
sustratos radioactivos. La expresión de genes a nivel ARNm se comparó aplicando PCR
cuantitativa, y a nivel proteína se evaluó utilizando técnicas de Western blot seguida de
inmunomarcación con anticuerpos, y en cortes de tejido por microscopía de
inmunofluorescencia.
En la primera parte de la tesis se compararon la localización y la distribución de
glicerofosfolípidos (GPL), colesterol y SM entre fracciones de membrana obtenidas de EP,
ER y ET. El foco estuvo puesto en la distribución lateral de las especies moleculares de SM
y Cer con VLCPUFA entre fracciones de membrana conteniendo dominios tipo raft y no-raft,
partiendo de la hipótesis de que estas especies se verían excluidas de los primeros.
Utilizando preparaciones de CT, inicialmente comparamos dos métodos, originalmente
diseñados para estudiar la separación lateral de proteínas en membranas, para decidir cuál
sería más apropiado para evaluar la distribución lateral de los lípidos. El método clásico, que
utiliza detergente en frío para obtener fracciones de membrana ricas en dominios tipo raft,
mostró bajas recuperaciones de lípido y proteína, separación incompleta de los lípidos entre
dominios, interferencia del detergente en los análisis, e hidrólisis parcial de GPL y SM. Se
encontró preferible un método que usa gradientes de sacarosa para separar fracciones de
membrana sobre la base de su densidad a partir de homogenados totales (HT), pues
permitió separar fracciones de membrana livianas, pesadas, y extra-pesadas (ML, MP y
MEP, respectivamente) además de una fracción aún más pesada en el pellet o sedimento
de la homogenización. La recuperación, tanto del fósforo lipídico como de la proteína,
alcanzó, en promedio, un 85% del originalmente presente en los HT. Proteínas marcadoras
mostraron que las pequeñas ML contenían dominios tipo-raft/caveolas, y las abundantes MP
dominios no-raft, principalmente derivados de la membrana plasmática, mientras las MEP
eran ricas en membranas intracelulares. Consistente con su rol como precursoras de
esfingolípidos con VLCPUFA, especies de Cer con n-V y h-V se hallaron más concentradas
en las MEP. Como se esperaba, las ML contenían GPL y SM con AG saturados, mientras
las MP eran ricas en GPL con PUFA y SM con VLCPUFA. Llamativamente, tal vez debido a
la alta insaturación de esos ácidos grasos, la relación colesterol/fosfolípidos fue más alta en
las MP que en las ML. Con el avance de la diferenciación, el contenido de Cer con
VLCPUFA, especialmente h-V Cer, tendió a aumentar en las MP de las CG en el sentido
EP→ER→ET. En el mismo sentido, mientras los ácidos grasos de los lípidos de ML no
variaron, en los de las MP las relaciones 22:5n-6/20:4n-6 en GPL y h-V/n-V en SM y en Cer
aumentaron en forma altamente significativa.
En la segunda parte, se determinó la expresión de enzimas que se espera jueguen un
papel en la biosíntesis de los n-V y los h-V de SM y Cer. El foco estuvo puesto en la Elovl4 y
la Fa2h, con la hipótesis, basada en lo que habían mostrado los lípidos, de que sus
expresiones aumentarían con el desarrollo postnatal en el testículo y que, en las CG de
animales adultos, variarían en sentidos opuestos, la primera disminuyendo y la segunda
aumentando con la diferenciación. Seis de los 7 miembros de la familia de genes Elovl, se
expresaron a nivel ARNm en CG. Los genes Elovl5 y Elovl2 se incluyeron en el estudio por
codificar elongasas cuya actividad parcialmente se superpone, colaborando en la
biosíntesis de PUFA, y porque Elovl2 es esencial en la formación de PUFA de 24 carbonos
que sirven de sustrato a la Elovl4. Contrario a lo esperado, el nivel de ARNm de Elovl4 se
halló elevado en testículos que virtualmente carecían de CG (y de SM o Cer con n-V), como
lo fueron los de animales en edades infantiles (P14) y los de adultos (P90) que habían sido
despojados de CG por exposiciones repetidas a episodios de hipertermia. Esta aparente
inconsistencia se debió a que el nivel de ARNm de Elovl4 fue inesperadamente alto en las
SC. Con la maduración sexual, los niveles de Elovl4-ARNm en el testículo decrecieron hasta
la adultez, para permanecer luego relativamente constantes. Entre las células
espermatogénicas del adulto, los contenidos más altos de este ARNm aparecieron en las ET
y en los CR. En contraste con Elovl4, Fa2h no se expresó como ARNm en el testículo hasta
la edad de aparición de las ER (P26), y sus niveles aumentaron con el crecimiento y la
diferenciación celular. Como proteínas, ni Elovl4 ni Fa2h se expresaron en las SC. Elovl4
estuvo más concentrada en EP que en ER, en las que mostró una localización perinuclear.
En el citoplasma de las ET apareció concentrada en pequeñas estructuras esféricas que
podrían ser CR en formación. Como proteína, Fa2h se encontró especialmente concentrada
en las ET, asociada a una estructura supranuclear que juega un rol importante en dar la
forma definitiva a la cabeza de los futuros espermatozoides. Elovl4 y Fa2h no se detectaron
en las gametas liberadas desde el epitelio seminífero. La actividad combinada de las
elongasas en estudio (Elovl5, Elovl2 y Elovl4) se evaluó comparando las conversiones
sufridas por el [3H]20:4n-6 en cultivos de EP, ER y ET, así como de SC. Este PUFA fue
elongado en las cuatro poblaciones celulares a [3H]22:4 y [3H]24:4, y estos productos fueron
activamente desaturados a [3H]22:5 y [3H]24:5. Como se esperaba, se encontraron n-V
tetraenoicos y pentaenoicos marcados con [3H] de 26 y hasta 32 carbonos sólo en las CG.
La actividad de elongación de PUFA decreció en el sentido EP→ER→ET.
En la tercera parte, con la hipótesis de que las CG serían capaces de producir sus
propios esfingolípidos, investigamos cómo espermatocitos y espermátidas biosintetizan Cer,
SM y GlcCer, y cómo dicha actividad, así como la expresión de los genes de las
correspondientes sintasas, cambian con la diferenciación. Paralelamente evaluamos la
posibilidad de que la biosíntesis y/o la expresión génica estuvieran afectadas por la
testosterona (Tes) y por factores solubles liberados desde las SC. Empleando como
precursor al [3H]16:0 y dos inhibidores específicos de la ruta biosintética de novo (Lcicloserina
y fumonisina B1) hallamos que las CG, aisladas y en cultivo, son capaces de
biosintetizar sus propias Cer y SM, incluyendo sus especies moleculares con VLCPUFA,
además de GlcCer. Estas actividades biosintéticas fueron máximas en los EP, disminuyendo
con la diferenciación (EP>>ER). La Tes estimuló la biosíntesis de [3H]SM sólo en las ER. La
suplementación con el medio condicionado obtenido de cultivos de SC (MCS) estimuló
significativamente la formación de [3H]Cer tanto en EP como en ER, la de [3H]SM sólo en
ER, y la de [3H]GlcCer sólo en EP. La Tes y el MCS incrementaron a todas las especies
moleculares de Cer y de SM, incluyendo las n-V. En comparación con el MCS sólo, la
combinación Tes+MCS promovió significativamente la biosíntesis de [3H]SM en los EP,
mientras la redujo en las ER, en las cuales incrementó la marcación de [3H]Cer y de
[3H]GlcCer. El estímulo sobre la marcación de Cer y SM fue específico para las [3H]n-V Cer y
[3H]n-V SM. El significativo fomento que sobre la biosíntesis de novo ejerció el MCS indica
que factores solubles (o transportados en microvesículas) provenientes de las SC
(incluyendo tal vez distintas formas de ARN), juegan un rol en promover, en las CG, la
biosíntesis de esfingolípidos destinados a sus membranas.
En esta tercera parte de la tesis también se investigó la expresión a nivel ARNm de
genes que codifican para cuatro sintasas (S) clave implicadas en la biosíntesis de SL
(CerS3, SMS1, SMS2, y GlcCerS), de tres elongasas de ácidos grasos (Elovl5, Elovl2 y
Elovl4), y de Fa2h. Se encontró que los niveles de ARNm de CerS3 fueron máximos en EP y
los de SMS2 máximos en ER, ambos disminuyendo en las ET. Los de GlcCerS
disminuyeron menos que éstos con la diferenciación, y los de SMS1 no variaron. Los cuatro
ARNm también aparecieron en los CR. Mientras CerS3 no se expresó en las SC, los ARNm
de las demás sintasas se encontraron en ellas, aunque en cantidades menores que en las
CG. En la última parte de esta sección se estudiaron, en las células espermatogénicas
totales, los efectos de la Tes, del MCS, y de Tes+MCS sobre los niveles de ARNm de las
enzimas mencionadas. Las expresiones como ARNm de Elovl2 y Elovl4 mostraron ser
reguladas por el MCS, las de SMS2 y Elovl5 por MCS y Tes, y la de Fa2h sólo por Tes. La
Tes y el MCS, tanto por separado como combinados, no afectaron los niveles de ARNm de
CerS3, SMS1, o GlcCerS, mientras tendieron a reducir los de SMS2. La presencia de Tes
no afectó el ARNm de Elovl2 ni el de Elovl4, mientras tendió a aumentar el de Elovl5. El
MCS, por su parte, redujo significativamente los ARNm de las tres elongasas. Cuando Tes y
MCS se combinaron, el ARNm de Elovl5 aumentó, y los de Elovl2 y Elovl4 continuaron
bajos, recapitulando la influencia de Tes y del MCS, respectivamente. El efecto más
significativo de la Tes, tanto sola como combinada con el MCS, fue el de estimular la
expresión de Fa2h. Tomados en conjunto, estos resultados muestran por primera vez que
factores que juegan roles fisiológicos en la espermatogénesis, como lo son la testosterona y
moléculas liberadas desde las células de Sertoli, son capaces de estimular la biosíntesis de
novo de esfingolípidos en las células espermatogénicas y de regular, en algunos casos a la
alta y en otros a la baja, la expresión génica de algunas de las enzimas responsables de
dicha biosíntesis. |