Síntesis y caracterización de partículas magnéticas para su aplicación en biotecnología
La presente tesis estudia dos líneas de investigación paralelas y complementarias: por un lado, la síntesis de partículas de magnetita mediante el método de co-precipitación en presencia de surfactantes; por otro lado el diseño de biocatalizadores a base de la lipasa B de Candida Antarctica (CALB) y...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | tesis doctoral |
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| Publicado: |
2017
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Tecnología de los materiales Biotecnología Nanopartículas Biocatálisis Magnetita CALB (Lipasa B de candida antarctica) |
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La presente tesis estudia dos líneas de investigación paralelas y complementarias: por un lado, la síntesis de partículas de magnetita mediante el método de co-precipitación en presencia de surfactantes; por otro lado el diseño de biocatalizadores a base de la lipasa B de Candida Antarctica (CALB) y soportes magnéticos. La CALB ha sido estudiada en profundidad por el grupo de biocatálisis del instituto PLAPIQUI a lo largo de varios años. La performance de los biocatalizadores obtenidos fue testeada en la reacción de esterificación de ácido oleico con etanol sin solvente.
El capítulo I introduce los conceptos básicos sobre catálisis en general y, con un nivel mayor de detalle, los relacionados con la catálisis enzimática resaltando su importancia en relación a múltiples aspectos biotecnológicos, ambientales y económicos.
Se resumen los distintos métodos de inmovilización estudiados en la literatura a lo largo de la historia de esta disciplina, señalando las ventajas y desventajas de cada uno. También se hace una revisión de la variedad de materiales utilizados como soportes sólidos.
Se puntualiza en soportes magnéticos, en particular a base de nanopartículas del óxido de hierro Fe3O4, magnetita (MAG). Se explicitan las características de la MAG, seleccionada para este trabajo. Las estrategias de síntesis de este óxido de hierro son brevemente reseñadas, profundizando en el método de co-precipitación. Finalmente se enumeran los objetivos puntuales de las tesis.
En el capítulo II se detalla el procedimiento experimental para la inmovilización de CALB. Se establecen las condiciones de reacción en las que se medirá la actividad catalítica (reacción test) y un protocolo de muestreo adecuado para la determinación de conversión. Por último, se describen las técnicas de caracterización aplicadas a los catalizadores y materiales precursores junto con el tratamiento necesario de las muestras para cada una.
El capítulo III incluye el estudio de la síntesis de los soportes nanoparticulados a base de magnetita. Se analizan la influencia del tipo y
concentración de estabilizante empleado en el medio de coprecipitación de MAG sobre las propiedades fisicoquímicas de las partículas formadas. Los modificantes explorados fueron ácido oleico, dodecilsulfato de sodio, polietilénglicol de alto peso molecular (35000) y hexametiléntetramina. Además, se estudia la funcionalización de las partículas magnéticas con grupos amino (NH2) empleando quitosano (QUIT) o lisina. Las muestras fueron caracterizadas por SEM-EDX, TEM, DRIFTS y DLS. Se establecen las formas en que cada sustancia orgánica participa en el mecanismo de cristalización y mediante éste se logra explicar las diferencias observadas en el tamaño, forma y funcionalidad superficial de las partículas.
En el capítulo IV se estudia la inmovilización covalente de CALB sobre partículas magnéticas modificadas con ácido oleico, quitosano (QUIT) y glutaraldehído (GLUT). Las interacciones QUIT-GLUT, GLUT-CALB y CALB-CALB son estudiadas en profundidad. Se propone una relación entre las propiedades del soporte y el biocatalizador con la actividad catalítica. En base a esta relación, se sugiere un mecanismo de inmovilización que explica el comportamiento del sistema y se determinan cuáles son las variables críticas a ajustar para mejorar el protocolo de inmovilización.
En el capítulo V constituye un trabajo de optimización del catalizador preparado en el capítulo IV. Para ello, se investiga la inmovilización de CALB sobre el mismo soporte estudiado en el capítulo IV, previa modificación de la superficie con cantidades variables de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTS) y de más GLUT. La influencia de la cantidad nominal de CALB ofrecida también fue evaluada. Un programa computacional se empleó para diseñar los experimentos y analizar estadísticamente los resultados. Se obtuvieron modelos matemáticos que permitieron identificar las variables significativas para cada respuesta evaluada: conversión, carga enzimática y actividad específica. Se seleccionaron los mejores catalizadores para comprobar su estabilidad operacional y retención de actividad en almacenamiento. Los mecanismos de inmovilización sobre las distintas superficies que explican estas propiedades son propuestos. Los diferentes catalizadores y materiales precursores fueron caracterizados ampliamente por varias técnicas.
En el capítulo VI se exploran distintos métodos de cuantificación de proteínas en vista de los errores encontrados en los más comunes (Bradford, Lowry) y que se implementan en forma rutinaria para el cálculo de la carga enzimática en los biocatalizadores preparados. CALB fue determinada en el caldo comercial, los sobrenadantes de inmovilización y aguas de lavado de varias muestras mediante 4 protocolos distintos, combinando el clásico ensayo de Bradford con la determinación de azufre por emisión atómica. Se analizó la influencia del patrón de concentración elegido para el método colorimétrico y se identificaron las interferencias presentes en ambas técnicas. Fue posible establecer un protocolo de cuantificación de esta lipasa que, a diferencia de otros, arrojó valores de carga enzimática concordantes con la actividad de los catalizadores. La demostración de los errores sistemáticos cometidos a través del ensayo de Bradford sugiere que este método sea recon siderado – e incluso descartado- para cuantificar cualquier proteína, ya sea en un medio de inmovilización o no.
En el capítulo VII se investiga la inmovilización de CALB un nuevo soporte: magnetita funcionalizada con el aminoácido lisina (LIS). Este material posee propiedades diferentes a MAG-QUIT en cuanto a tamaño de partícula y estabilidad en suspensión acuosa. El acoplamiento de la lipasa se realizó mediante dos técnicas: A- adsorción simple sobre MAG-LIS seguida de entrecruzamiento con GLUT de concentración variable, y B-activación de MAG-LIS con GLUT de una concentración específica (determinada según los resultados del método A) y posterior inmovilización covalente. Se logró diseñar un protocolo que permite obtener un biocatalizador activo, fácilmente separable del medio de reacción, reutilizable, resistente a los reusos y total preservación de actividad durante largos períodos de almacenamiento.
En capítulo VIII se enumeran las conclusiones globales de todo la investigación realizada y se establecen los lineamientos considerados pertinentes para el trabajo a futuro. |