Las diacilglicerol quinasas en los núcleos de las células fotorreceptoras de la retina bovina : efectos de la luz y la insulina
El diacilglicerol (DAG) es un importante intermediario en la síntesis de muchas clases de lípidos, y es, además, un segundo mensajero producido en respuesta a diversos estímulos extracelulares, capaz de modular la actividad de numerosas enzimas. Una de las vías de metabolización del DAG es la fos...
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2015
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El diacilglicerol (DAG) es un importante intermediario en la síntesis de muchas clases
de lípidos, y es, además, un segundo mensajero producido en respuesta a diversos
estímulos extracelulares, capaz de modular la actividad de numerosas enzimas. Una
de las vías de metabolización del DAG es la fosforilación llevada a cabo por las DAGK,
para dar ácido fosfatídico (PA). El ácido fosfatídico es también un importante segundo
mensajero lipídico involucrado en una gran variedad de respuestas celulares.
Dada la importancia fisiológica del DAG y del PA como segundos mensajeros lipídicos,
y, teniendo en cuenta los numerosos resultados que indican la presencia de las vías
de señalización responsables de la síntesis y degradación de estos segundos
mensajeros a nivel nuclear, iniciamos nuestros estudios analizando la actividad de las
DAGK en los núcleos de la retina bovina, proyectando la investigación hacia la
interpretación de su participación en las funciones esenciales de la retina, la recepción
y transmisión de la luz. Además, analizamos a nivel nuclear, en las células
fotorreceptoras de la retina, los efectos de la insulina, un reconocido protector del
sistema nervioso central (SNC) y modulador de la actividad DAGK en otros tipos
celulares del SNC.
Mediante un protocolo diseñado en nuestro laboratorio, obtuvimos a partir de la retina
entera una fracción nuclear enriquecida en los núcleos de las células fotorreceptoras
(FNF). En esta fracción nuclear, se pudo detectar actividad DAGK, transformadora del
DAG endógeno y exógeno. Se determinó linealidad en función del tiempo de ensayo,
el contenido proteico de la fracción nuclear y se analizaron parámetros cinéticos
aparentes (Km y Vmax para cada sustrato). Los resultados con detergentes y
sustratos diferentes permitieron sugerir la coexistencia de varios tipos de DAGK. Esto
fue confirmado por Western Blot (WB) y se detectaron, además, efectos significativos
en el contenido nuclear de estas isoformas por efecto de la luz (aumento de la DAGKδ
y disminución de las DAGKe, ß y B).
Nuestros hallazgos se reforzaron con ensayos enzimáticos en los que se utilizaron
condiciones selectivas (preferenciales) para medir la actividad de las isoformas δ y e.En ellos se observó, por efecto de la exposición de la retinas a la luz, una fuerte
correlación entre los cambios en el contenido y la actividad de ambas isoformas en la
FNF.
Se demostró asimismo que el aumento de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la
luz es dependiente de la actividad PIP2-PLC, y se observó que dicho incremento en la
condición lumínica no es debido exclusivamente a un aumento del sustrato de la
reacción enzimática, DAG, sino que también participa en la activación el PIP2.
También demostramos la presencia de la PKCα en la FNF, PKC de tipo convencional
que es activada en presencia de Ca2+ y DAG. La exposición de las retinas a la luz
produjo un aumento del estado de fosforilación de la PKCα.
Dado que la fosforilación de PKC puede ser mediada por la activación de PDK1, que
es dependiente de la activación previa de PI3K, enzima participante de la vía de
señalización de insulina, el siguiente objetivo fue determinar la presencia de los
principales componentes de las vías de señalización de insulina en la FNF. Nuestros
resultados demostraron la presencia de Akt total y en su estado fosforilado (proteína
quinasa de la via de la PI3K), y de ERK1/2, pERK1/2 y p38 fosforilada (quinasas
correspondientes a la vía de las MAPK). Nuestros estudios demostraron, además, que
la exposición de las retinas bovinas a la luz produce un aumento en el estado de
fosforilación de Akt, y que induce la translocación de ERK1/2 activada a la FNF.
Por otro lado, al analizar los efectos directos e indirectos de la insulina sobre la
actividad DAGK nuclear en la FNF de retinas expuestas a la luz o a la oscuridad, fue
posible demostrar que la insulina es capaz de modular la actividad DAGK nuclear tanto
de forma directa (incubación de los núcleos aislados con insulina) como de manera
indirecta (incubación de las retinas bovinas con insulina y posterior análisis de la
actividad DAGK en la FNF). Además, se observó que la insulina cumple un rol en los
cambios de la actividad DAGK nuclear en respuesta a la luz, y que los efectos de la
insulina sobre la actividad DAGK son dependientes de su concentración (los efectos se incrementan con un aumento concomitante de la concentración de insulina
empleada en el ensayo enzimático).
Teniendo en cuenta los efectos directos de la insulina sobre la actividad DAGK
nuclear, analizamos la presencia del receptor de insulina en la FNF por WB e
inmunofluorescencia (IF) y demostramos la presencia del mismo en los núcleos de las
células fotorreceptoras. Un hallazgo de particular interés fue el de haber demostrado
que el contenido del RI aumenta en la FNF cuando las retinas bovinas son expuestas
a la luz, lo cual sugiere que la luz puede ser un estímulo capaz de promover la
translocación del RI al núcleo de las células fotorreceptoras.
Por último, analizamos si la insulina es capaz de participar en la translocación del
receptor de insulina al núcleo de las células fotorreceptoras y de mediar la activación
de las vías de señalización activadas por la misma a nivel nuclear. Nuestros resultados
indicaron que la insulina produce un aumento en el contenido del receptor de insulina
nuclear con respecto a la condición luz en ausencia de hormona. Además, la insulina
produjo un aumento de ERK1/2 activado en la FNF.
En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez que la exposición de
las retinas bovinas a su estímulo natural, la luz, paralelamente a la activación de la
típica vía de la fototransducción que se inicia en los segmentos externos, induce a
nivel nuclear, la activación de distintas vías de señalización responsables de funciones
críticas para la célula, y que a nivel nuclear, pueden intervenir en la transcripción de
genes. Nuestros resultados demostraron también que la luz y la insulina son capaces
de intervenir en la translocación del receptor de insulina desde la membrana
plasmática hacia el núcleo de las células fotorreceptoras, y que la insulina promueve la
activación de vías de señalización tanto de forma indirecta, actuando sobre la retina
entera, como directa a nivel nuclear, sugiriendo para este último caso que mediaría
sus efectos a través de la población nuclear de dicho receptor. |