Mecanismo de asociación del receptor de acetilcolina nicotínico a su microentorno lípido

El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es una proteína integral de membrana, en íntimo contacto con los lípidos de la misma. El objetivo de este trabajo de Tesis fue analizar si las propiedades intrínsecas del AChR son las que determinan su partición en un determinado dominio de lípidos. Para...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Bermúdez, Vicente
Otros Autores: Barrantes, Francisco J.
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2011
Materias:
Bioquímica
Biofísica
Sistema nervioso
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2148
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description El receptor de acetilcolina nicotínico (AChR) es una proteína integral de membrana, en íntimo contacto con los lípidos de la misma. El objetivo de este trabajo de Tesis fue analizar si las propiedades intrínsecas del AChR son las que determinan su partición en un determinado dominio de lípidos. Para ello se eligió el tipo de AChR con mejor caracterización, el del tejido eléctrico del pez marino Torpedo. El AChR completo, purificado a partir de T. californica, se reconstituyó en membranas mode-lo con proporciones definidas de colesterol, esfingomielina y fosfatidilcolina, y luego se procedió a su análisis mediante téc-nicas bioquímicas y biofísicas. Una porción del AChR que se sabe reside normalmente en el interior de la membrana, el péptido sintético γM4, se estudió de manera similar con el objetivo de aprender acerca de la contribución del anillo exte-rior del segmento transmembrana, en contacto directo con los lípidos, en la supuesta segregación lateral en la membrana del AChR. La distribución del AChR o del péptido γM4 se evaluó por extracción de los liposomas con el detergente no-iónico Triton X-100, y su posterior centrifugación, para obtener membranas resistentes al detergente (DRM). Se ha postulado que tales fracciones serían el homólogo bioquímico de los dominios de lípidos tipo balsa ("rafts") preexistentes en la membrana plasmática de células. La contrapartida de tales fracciones, las denominadas "no-rafts", son las membranas solubles en el detergente (DSM). Se estudió también la in-fluencia de la rapsina (una proteína periférica involucrada en agrupamiento del AChR) o de la agregación de dominios tipo-rafts (utilizando membranas que contienen al gangliósido GM1 seguido por el entrecruzamiento de GM1). Los resultados experimentales permiten concluir que el péptido γM4 exhibe una marcada preferencia por los dominios tipo-rafts. Por el contrario el AChR, ya sea solo o en presencia de la proteína rapsina, o de la agregación del gangliósido GM1, no exhibió tal preferencia por los dominios tipo-rafts. La composición lipídica de las fracciones DRM y DSM obtenidas a partir de liposomas compuestos sólo por fosfatidilcolina:esfingomielina:colesterol en proporciones equimolares, o por la mismo mezcla de lípidos con γM4 o AChR incorporado, estaba enriquecida en todos los casos en colesterol y esfingomielina en la fracciones DRM, y enriquecidas en fosfatidilcolina en las fracciones DSM. Estos resultados demuestran que la composición lipídica de estas fases depende principalmente de las propiedades de los lípidos que las componen. Sin embargo, la proporción de cada dominio de lípidos depende de la presencia del AChR o del péptido γM4. El AChR produjo un aumento significativo en la cantidad total de la fracción DSM, con una reducción concomitante en la cantidad total de la fracción DRM. Por otra parte, γM4 aumentó la proporción de la fracción DRM. Por lo que inferimos que el péptido γM4 actuaría como un promotor de DRM y el AChR completo, por el contrario, actua-ría como un perturbador de DRM. La eficiencia de la transfe-rencia de energía resonante de Förster entre la fluorescencia intrínseca de la proteína (o del péptido) y el dehidroergosterol (mimético fluorescente del colesterol) sirve como una medida de la localización de la proteína en la membrana. La sonda fluorescente Laurdan como aceptora se utilizó como control, ya que no muestra ninguna partición preferencial por un dominio en particular. Los valores de la denominada polariza-ción generalizada, calculados a partir de los espectros de fluorescencia de la sonda Laurdan, fueron utilizados como informativos de las condiciones biofísicas de cada membrana. El AChR purificado no tuvo una partición preferencial entre dominios rafts (dominios enriquecidos en colesterol) y domi-nios no-rafts, mientras que el péptido γM4 se particionó preferentemente en dominios rafts. Podemos inferir que la predilección del AChR en su medio natural por un dominio dado de lípidos no puede ser atribuida exclusivamente a las propiedades fisicoquímicas de ambos o a las interacciones entre el dominio TM de la proteína y el ambiente lipídico, por lo que debería haber señales exteriores en las membranas celulares nativas que direccionen al AChR hacia un dominio de membrana específico.

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