"Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la Retinitis Pigmentosa (RP), se caracterizan por la pérdida de las neuronas fotorreceptoras por apoptosis, que conduce a la ceguera. Pese a la extensa investigación realizada no se ha podido avanzar en su tratamiento; sin embargo, la posibilida...

Descripción completa

Guardado en:
Detalles Bibliográficos
Autor principal: Miranda, Gisela Edit
Otros Autores: Rotstein, Nora Patricia
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2010
Materias:
lipídos
diferenciación
proliferación
supervivencia
retina
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2099
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
id I20-R126123456789-2099
record_format dspace
institution Universidad Nacional del Sur
institution_str I-20
repository_str R-126
collection Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS)
language Español
orig_language_str_mv spa
topic lipídos
diferenciación
proliferación
supervivencia
retina
spellingShingle lipídos
diferenciación
proliferación
supervivencia
retina
Miranda, Gisela Edit
"Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
topic_facet lipídos
diferenciación
proliferación
supervivencia
retina
author2 Rotstein, Nora Patricia
author_facet Rotstein, Nora Patricia
Miranda, Gisela Edit
format tesis doctoral
author Miranda, Gisela Edit
author_sort Miranda, Gisela Edit
title "Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
title_short "Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
title_full "Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
title_fullStr "Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
title_full_unstemmed "Rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
title_sort "rol de los lípidos en la regulación de la diferenciación, proliferación y supervivencia de neuronas de retina"
publishDate 2010
url http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2099
work_keys_str_mv AT mirandagiselaedit roldeloslipidosenlaregulaciondeladiferenciacionproliferacionysupervivenciadeneuronasderetina
bdutipo_str Repositorios
_version_ 1764820505171329024
description Las enfermedades neurodegenerativas de la retina, como la Retinitis Pigmentosa (RP), se caracterizan por la pérdida de las neuronas fotorreceptoras por apoptosis, que conduce a la ceguera. Pese a la extensa investigación realizada no se ha podido avanzar en su tratamiento; sin embargo, la posibilidad de regeneración neuronal y la identificación de células progenitoras multipotentes (stem cells) en la retina (Reh y col., 1998; Tropepe y col., 2000), permiten proponer la combinación de dos enfoques simultáneos para el tratamiento de estas enfermedades: impedir la apoptosis de los fotorreceptores y estimular la proliferación de progenitores neuronales para restaurar las neuronas perdidas. La aplicación de este nuevo enfoque requiere un conocimiento a nivel molecular de los mecanismos de regulación del ciclo celular y de aquellos que posibilitan inducir la diferenciación de progenitores indiferenciados en el tipo neuronal deseado. En el laboratorio de Neurobiología del INIBIBB se ha establecido que dos factores tróficos participan activamente en la regulación del ciclo celular de neuroblastos precursores de fotorreceptores: el Factor Neurotrófico Derivado de la Glia (GDNF), que aumenta el número de precursores multipotentes y estimula el ciclo celular, y el Acido Docosahexaenoico (DHA) que induce la salida del ciclo celular de los fotorreceptores y estimula su diferenciación (Rotstein y col., 1996; Rotstein y col., 1997; Rotstein y col., 1998; Politi y col., 2001a; Politi y col., 2001b; Insua y col., 2003). Esto indicaría que en conjunto, ambos factores tróficos estarían actuando para definir el número final de fotorreceptores en la retina, a través del control de la proliferación, diferenciación y supervivencia. Trabajos realizados en el laboratorio nos han permitido establecer por primera vez que la ceramida actúa como segundo mensajero en neuronas de retina de rata, activando la apoptosis inducida por estrés oxidante (German y col., 2006b). Determinamos también que el DHA disminuye los niveles de ceramida para proteger a los fotorreceptores de dicho estrés, modulando la actividad y/o niveles de la glucosil ceramida sintetasa. Estos hallazgos sugieren que otras enzimas de esta vía, y por consiguiente otros esfingolípidos bioactivos podrían intervenir en el control de la supervivencia, proliferación y diferenciación neuronales. La esfingosina-1-fosfato (S1P) es un esfingolípido con importantes funciones biológicas; actúa como molécula señal extra e intracelular, regulando procesos biológicos críticos, como la proliferación, diferenciación, y supervivencia. La ceramida-1-fosfato (C1P) es otro esfingolípido cuyas funciones como regulador de la supervivencia y proliferación celular han sido descubiertas recientemente. La información existente sobre el rol de la S1P y C1P en el sistema nervioso y en la retina es muy escasa. Por ello fueron objetivos centrales de este trabajo de tesis investigar si la S1P y la C1P tienen un papel regulatorio en la proliferación y diferenciación neuronal en la retina. Existen numerosos modelos animales de las enfermedades neurodegenerativas de la retina que posibilitan evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la degeneración, así como terapias para el tratamiento de las mismas. El ratón rd1 es uno de los animales más usados como modelo de estas enfermedades, ya que presenta una pérdida selectiva, irreversible y rápida de los fotorreceptores. Por estos motivos, elegimos este modelo para estudiar el proceso de degeneración in vitro de los fotorreceptores y el efecto del DHA sobre dicho proceso. El hallazgo de que los fotorreceptores de ratones rd degeneran por apoptosis durante el desarrollo temprano in vitro, y la reciente identificación en nuestro laboratorio de la ceramida y la esfingosina como mediadores claves en la apoptosis inducida por daño oxidante o por ausencia de factores tróficos de los fotorreceptores de retina de rata (German y col., 2006b; Abrahan y col., 2009a), nos llevaron a investigar también si estos esfingolípidos tendrían un papel en la apoptosis de los fotorreceptores rd durante el desarrollo temprano in vitro. El sistema de cultivo in vitro utilizado en nuestro laboratorio posibilita obtener cultivos neuronales puros enriquecidos en neuronas fotorreceptoras y amacrinas a partir de retinas de ratas y ratones de 0 a 2 días de nacidos, y mantenerlas por una a dos semanas en medio químicamente definido. La utilización de estos cultivos permitió analizar los mecanismos moleculares que rigen la proliferación, diferenciación y supervivencia de las neuronas fotorreceptoras y la modulación de dichos procesos por diversos factores. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue evaluar los efectos de la S1P sobre la proliferación de progenitores de fotorreceptores. Utilizando cultivos neuronales de retina de ratas de día 0, determinamos que la S1P aumentó diversos parámetros indicadores del avance del ciclo celular, como la incorporación de BrdU y la cantidad de figuras mitóticas observadas, lo que sugiere que promueve la proliferación de los progenitores de fotorreceptores en cultivo. Analizamos además el papel de la S1P en la diferenciación de los fotorreceptores, una vez avanzado el desarrollo in vitro. Utilizando inmunocitoquímica y Western Blot establecimos que la S1P promovió la expresión de dos proteínas específicas de este tipo celular, la opsina, que forma parte del pigmento visual, y la periferina, proteína de los discos de los segmentos externos. La estimulación de la expresión de opsina y periferina fue independiente del transporte retículo endoplasmático-Golgi, ya que no se vio afectado por el tratamiento con Brefeldina A (BFA), que bloquea dicho transporte. La S1P también estimuló la formación de rudimentos de los segmentos externos, denominados procesos apicales, y promovió la localización de opsina y periferina en dichas estructuras, proceso bloqueado por la BFA. Estos resultados indican que la S1P tendría una acción a nivel transcripcional, sobre la expresión de opsina y periferina, no alterada por el agregado de BFA, pero su efecto sobre la formación de los procesos apicales requeriría del tráfico de estas proteínas al extremo de los cilios para su localización en los segmentos externos. Investigamos después si la S1P podría actuar como mediadora de los efectos de diversos factores tróficos sobre los fotorreceptores. En otros tipos celulares, se ha establecido que distintos factores tróficos aumentan los niveles de la S1P. Nuestro hallazgo previo de que el DHA modula la actividad de la glucosil ceramida sintetasa y la similitud de los efectos ejercidos por la S1P con los de GDNF y DHA nos llevó a investigar si estos factores tróficos podrían modular los niveles de la S1P para ejercer sus acciones en las neuronas fotorreceptoras. Determinamos que tanto el GDNF como el DHA requieren de un aumento en los niveles de S1P para producir sus efectos. La inhibición de la esfingosina quinasa 1 (SphK1), enzima involucrada en la síntesis de S1P, con un inhibidor competitivo, el DHS, bloqueó los efectos del GDNF y del DHA sobre la proliferación y diferenciación de las neuronas fotorreceptoras. Evaluamos entonces a través de qué mecanismos el GDNF y DHA afectaban la síntesis de S1P. Para ello, investigamos su efecto en la expresión de la SphK1, mediante inmunocitoquímica y Western Blot. Demostramos que ambos factores tróficos aumentaron la expresión de la enzima y promovieron su localización en la membrana plasmática, mecanismo promovido por otros factores tróficos para activar a esta enzima (Toman y col., 2004). Los resultados obtenidos indican que la S1P sería un mediador de los efectos de los factores estudiados, para promover la proliferación y diferenciación de los fotorreceptores. Otro de los objetivos de este trabajo de tesis fue evaluar los efectos de la C1P en las neuronas fotorreceptoras de retina. El agregado de C1P a los cultivos neuronales obtenidos utilizando retinas de ratas de día 0 generó un aumento en la proliferación de los progenitores de fotorreceptores. Observamos también que la C1P promovió la diferenciación de estas neuronas a tiempos más avanzados del desarrollo in vitro, estimulando la expresión de opsina y periferina, favoreciendo la formación de procesos apicales y promoviendo la localización de dichas proteínas en los mencionados procesos. Estos efectos de la C1P son muy semejantes a los establecidos para la S1P, e indican que también la C1P podría estar implicada en la regulación del desarrollo de las neuronas fotorreceptoras. Otro de los objetivos de mi trabajo de tesis fue investigar el avance del proceso de degeneración in vitro de los fotorreceptores de ratones rd1 y el efecto del DHA sobre dicho proceso, comparándolo con el desarrollo de fotorreceptores obtenidos de retinas de ratones salvajes (wt). Determinamos que los fotorreceptores de ambas cepas murinas sufren un proceso de degeneración similar, con un aumento progresivo en la apoptosis. Esta apoptosis ocurre por la vía mitocondrial, ya que se observó una disminución en el número de fotorreceptores que presentaron depolarización mitocondrial. El DHA tuvo un efecto protector sobre los fotorreceptores de los ratones rd, disminuyendo la progresión de la apoptosis de los fotorreceptores durante el desarrollo temprano in vitro. En los fotorreceptores wt se observó un comportamiento similar. Investigamos también el proceso de diferenciación de los fotorreceptores en ambas cepas y el efecto del DHA sobre dicho proceso. Determinamos que a medida que trascurrió el tiempo de cultivo se evidenció un aumento en los parámetros de diferenciación de los fotorreceptores rd. El DHA estimuló esta diferenciación aumentando la expresión de opsina, la formación de procesos apicales y promoviendo la localización de esta proteína en dichos procesos. Un efecto semejante fue observado en los fotorreceptores wt. Investigamos también la posible participación de la ceramida como mediador en la apoptosis de los fotorreceptores rd. Inhibiendo la síntesis de ceramida con Fumonisina B1 determinamos que el bloqueo de dicha síntesis previno la muerte de los fotorreceptores, disminuyendo su apoptosis. Este resultado sugiere que el aumento en los niveles endógenos de ceramida sería necesario para la activación de la apoptosis de los fotorreceptores rd. Para discernir si la ceramida y/o el producto de su hidrólisis, la esfingosina, actúan como disparadoras de esta muerte, evaluamos el efecto de un inhibidor de la ceramidasa alcalina, el MAPP, sobre dicha muerte. Establecimos que, al contrario de lo que ocurre en la rata, la inhibición de la síntesis de esfingosina no disminuyó la apoptosis de los fotorreceptores, sino que por el contrario, generó un ligero aumento en dicha apoptosis. Estos resultados permiten proponer que la ceramida, y no la esfingosina, sería un mediador clave en la activación de la apoptosis de los fotorreceptores rd. En conclusión, los principales resultados obtenidos en este trabajo de tesis son:  La S1P estimula la proliferación de neuroblastos progenitores de fotorreceptores de rata en cultivo.  La S1P promueve la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras in vitro, incrementando los niveles de expresión de proteínas de los segmentos externos y estimulando la formación de procesos apicales.  La formación de los procesos apicales inducida por la S1P y el DHA requiere del tráfico de opsina y periferina al extremo de los cilios para su localización en los segmentos externos.  El GDNF y el DHA aumentan la expresión de la SphK y promueven su localización en la membrana plasmática, incrementando su actividad para generar un aumento en los niveles de S1P.  La S1P actúa como un mediador esencial para los efectos del GDNF y DHA sobre los fotorreceptores.  La C1P estimula la proliferación de los progenitores de fotorreceptores.  La C1P promueve la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras en cultivo.  El DHA incrementa la supervivencia de las neuronas fotorreceptoras de ratones rd y wt durante el desarrollo temprano in vitro.  El DHA estimula la diferenciación de las neuronas fotorreceptoras de ratones rd y wt.  La apoptosis de los fotorreceptores de ratones rd ocurre durante el desarrollo temprano in vitro requiere de la síntesis de ceramida pero no de la de su metabolito esfingosina.

Ejemplares similares