Rol de los esfingolípidos en los procesos activados por estrés oxidativo en neuronas y células gliales de retina

La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que participa en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen una característica en común, la presencia de daño oxidativo. Es...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Abrahan, Carolina Elizabeth
Otros Autores: Rotstein, Nora Patricia
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2010
Materias:
esfingolípidos
fotorreceptores
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2081
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description La apoptosis es un tipo de muerte celular programada que participa en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Muchas enfermedades neurodegenerativas de la retina involucran la muerte por apoptosis de las neuronales retinales, y tienen una característica en común, la presencia de daño oxidativo. Este estrés activa las vías que conducen a la apoptosis, y por lo tanto el conocimiento de los mecanismos por los cuales induce dicha activación es fundamental en el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas. Durante las últimas dos décadas los esfingolípidos han sido intensamente estudiados por su participación en la apoptosis y supervivencia celular. Esfingolípidos simples como la ceramida y el producto de su deacilación, la esfingosina, son segundos mensajeros proapoptóticos en muchos tipos celulares, mientras que la esfingosina-1-fosfato (S1P, por sphingosine-1-phosphate), que se sintetiza por fosforilación de esfingosina, tiene importantes funciones como promotor de la proliferación y supervivencia. Por lo tanto, la regulación del metabolismo de los esfingolípidos podría ser una herramienta importante para controlar la apoptosis durante las enfermedades neurodegenerativas. Trabajos anteriores del laboratorio demuestran que el daño oxidativo induce apoptosis en cultivos primarios de neuronas retinales, fotorreceptoras y amacrinas, de rata. Además establecimos que la ceramida es un mediador de la apoptosis por estrés oxidativo en fotorreceptores in vitro. La inducción de daño oxidativo con paraquat (PQ) incrementa los niveles de ceramida, a través de su síntesis de novo, y la inhibición de esta síntesis evita la apoptosis. Puesto que la ceramida puede degradarse a esfingosina, en esta tesis nos propusimos determinar si la esfingosina también es un mediador de la apoptosis en los fotorreceptores in vitro. Realizando experimentos metabólicos en cultivos neuronales puros de retina de rata, tratados con [3H]palmitato, determinamos que el daño oxidativo aumenta los niveles de esfingosina en los fotorreceptores, antes de la activación de la apoptosis. Además, mediante el método de TUNEL y marcación con Anexina/ioduro de propidio establecimos que el agregado exógeno de esfingosina también indujo apoptosis en las neuronas de la retina in vitro, asociada a la pérdida del potencial de membrana mitocondrial y la translocación del citocromo c de las mitocondrias al citosol. En diversos tipos celulares, la degradación de la ceramida a esfingosina, catalizada por ceramidasas, es necesaria para desencadenar la apoptosis. Para determinar si la apoptosis de los fotorreceptores, inducida por ceramida o por daño oxidativo, requiere de la síntesis de esfingosina, utilizamos un inhibidor de la ceramidasa alcalina. Demostramos que la inhibición de la ceramidasa alcalina bloquea la apoptosis activada por PQ o por ceramida exógena en los fotorreceptores. Muchos factores tróficos modulan el metabolismo de los esfingolípidos. En nuestro laboratorio demostramos que el ácido docosahexaenoico (DHA, por docosahexaenoic acid), un factor trófico para los fotorreceptores, los protege del daño oxidativo y dicha protección requiere de la formación de glucosilceramida. Uno de los objetivos de esta tesis fue estudiar si el DHA regula otros pasos del metabolismo de los esfingolípidos. Investigamos si el DHA controla la síntesis de S1P que como ya mencionamos, es un esfingolípido con importantes propiedades anti-apoptóticas. La S1P es sintetizada por la fosforilación de esfingosina a través de la actividad de esfingosinas quinasas, de las cuales se conocen dos isoformas, SphK1 y SphK2. Con diversas técnicas citoquímicas, determinamos que DHA protege a los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o por agregado de ceramida o esfingosina, y que la inhibición de la formación de S1P, catalizada por la SphK1 bloquea el efecto protector del DHA. Además, incubando a cultivos neuronales con [3H]esfingosina, establecimos que el DHA promueve la metabolización de la esfingosina a S1P. Por lo tanto, uno de los mecanismos por los cuales el DHA tiene un efecto antiapoptótico en los fotorreceptores sería a través del incremento de la síntesis de S1P, un esfingolípido antiapoptótico, disminuyendo los niveles de esfingosina, uno antiapoptótico. S1P también puede actuar extracelularmente a través de sus receptores de membrana. Existen 5 subtipos de estos últimos, denominados S1P1-5. En esta tesis, demostramos que la S1P exógena protege a los fotorreceptores de retina del daño oxidativo o de la apoptosis inducida por esfingosina a través de su receptor de membrana S1P3, puesto que el uso de un antagonista para éste bloquea el efecto protector de S1P. Debido a que luego de la síntesis de S1P, ésta puede ser transportada al medio extracelular, decidimos evaluar si DHA actúa a través de este mecanismo y la posterior activación del receptor S1P3. Demostramos que el bloqueo del receptor S1P3 no inhibe el efecto protector del DHA sobre los fotorreceptores de la apoptosis por daño oxidativo o esfingosina exógena. Por lo tanto, sugerimos que el DHA no requiere de la activación de S1P3 para proteger a los fotorreceptores del daño oxidativo; el DHA promovería la síntesis de S1P, que luego actuaría como mensajero intracelular o activaría a otros receptores distintos de S1P3. Las células gliales de Müller tienen importantes funciones de sostén metabólico y trófico para las neuronas de retina.Además, las células gliales podrían ser una fuente potencial de células madre. Por eso, el estudio de su capacidad para proteger a las neuronas así como de regenerarlas, podría hacer aportes al desarrollo de terapias para las enfermedades neurodegenerativas. Investigamos si las células de Müller son capaces de posponer la apoptosis neuronal por daño oxidativo en cocultivos neurogliales. Utilizando técnicas citoquímicas demostramos que los oxidantes PQ y peróxido de hidrógeno no activan la apoptosis glial ni la neuronal en cultivos gliales puros y cocultivos neurogliales, respectivamente. Mediante técnicas inmunocitoquímicas y Western blot establecimos que el estrés oxidativo indujo la proliferación glial, la disminución de la expresión de marcadores de diferenciación glial in vitro y un incremento de aquellos que indican dediferenciación. Por esto, proponemos que el estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller in vitro sugiriendo su capacidad para regenerar neuronas. A su vez, las células gliales protegen a las neuronas fotorreceptoras y amacrinas de la apoptosis inducida por estrés oxidativo. Diversos factores tróficos y diferentes vías de transducción de señales participan en la interacción neurona-glía de Müller, pero no se conoce si los esfingolípidos están involucrados en dicha interacción. Cuando estudiamos el efecto de S1P sobre las células gliales de Müller de retina de rata, por captación de Br-deoxiuiridna y de [3H]timidina, determinamos que este esfingolípido es un potente mitógeno,ya que estimula notablemente la proliferación glial. Investigamos también si S1P participa en los mecanismos desencadenados por las células de Müller para proteger a las neuronas retinales del daño oxidativo. Utilizando un inhibidor de la síntesis de S1P y un antagonista del receptor S1P3, determinamos que la formación de S1P y la activación de S1P3 son necesarias para que las células gliales de Müller promuevan la supervivencia de las neuronas de retina. Los resultados más importantes de esta tesis son: El estrés oxidativo induce la síntesis de esfingosina en fotorreceptores de retina de rata in vitro. El estrés oxidativo requiere de la formación de esfingosina, catalizada por la ceramidasa alcalina, para activar la apoptosis en las neuronas de la retina. La esfingosina, junto con la ceramida, sería un mediador esencial para la activación de la apoptosis debida al daño oxidativo. El DHA estimula la fosforilación de esfingosina a S1P en fotorreceptores. El DHA requiere la formación de S1P para retrasar la apoptosis de las neuronas retinales por estrés oxidativo y el agregado de ceramida o esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y por agregado de ceramida y esfingosina. La S1P protege a los fotorreceptores de la apoptosis inducida por daño oxidativo y esfingosina exógena a través de la activación del receptor de membrana S1P3. El DHA no requiere de la activación de S1P3 para posponer la apoptosis de los fotorreceptores por estrés oxidativo. La S1P sería un segundo mensajero cuya síntesis sería promovida por el DHA para ejercer sus efectos antiapoptóticos sobre los fotorreceptores de retina. El estrés oxidativo promueve la proliferación y dediferenciación de las células de Müller de rata in vitro, pero no su apoptosis. Las células gliales posponen la apoptosis de las neuronas por daño oxidativo. S1P es un potente inductor de la proliferación de las células de Müller. Las células de Müller requieren de la síntesis de S1P y la activación de S1P3 para proteger a las neuronas de la retina del daño oxidativo.

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