Estudio y caracterización de la fosfolipasa C específica para fosfatidilcolina (PC-PLC) en el sistema nervioso central

La fosfatidilcolina (PC) es uno de los glicerofosfolípidos más abundantes en las membranas celulares y es además fuente de segundos mensajeros lipídicos tales como el diacilglicerol (DAG), el ácido fosfatídico (PA), el ácido araquidónico (AA) y la lisofosfatidilcolina (LPC). Por su parte, el DAG es...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Mateos, Melina Valeria
Otros Autores: Salvador, Gabriela Alejandra
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2009
Materias:
fosfolipasa
fosfatidilcolina
sistema nervioso
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2010
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description La fosfatidilcolina (PC) es uno de los glicerofosfolípidos más abundantes en las membranas celulares y es además fuente de segundos mensajeros lipídicos tales como el diacilglicerol (DAG), el ácido fosfatídico (PA), el ácido araquidónico (AA) y la lisofosfatidilcolina (LPC). Por su parte, el DAG es capaz de mediar eventos celulares claves a través de la regulación de diversas proteínas entre las que encontramos: las proteínas quinasas C (PKC), las proteínas quinasas D (PKD), las quimerinas, las proteínas liberadoras de nucleótidos de guanina de Ras (RasGRPs), las Munc13s y las DAG quinasas (DAGK). Estos efectores del DAG participan en funciones celulares como la fusión y el tráfico de las membranas, la inflamación, la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. La generación de DAG por hidrólisis de la PC se produce en respuesta a diversos estímulos celulares y es catalizada principalmente por la acción de dos vías enzimáticas: por la activación de la fosfolipasa D (PLD) (enzima que genera PA, el cual es hidrolizado a DAG por la acción de una fosfatasa de ácido fosfatídico tipo 2 o PAP2) y por la reacción catalizada por la fosfolipasa C específica para PC (PC-PLC) la cual genera DAG y fosfocolina. Los principales objetivos de la presente tesis doctoral fueron demostrar la presencia de la vía de la PC-PLC en las terminales sinápticas (sinaptosomas) de la corteza cerebral de rata y estudiar el efecto del estrés oxidativo en la generación de DAG a partir de la PC. Los resultados de esta tesis fueron divididos en dos capítulos, en la primera parte estudiamos la presencia de la PC-PLC en los sinaptosomas de ratas adultas y seniles y realizamos la caracterización de esta actividad enzimática. En los sinaptosomas (Syn) de ratas adultas los agentes tensioactivos Triton X-100 y deoxicolato de sodio (DOC) estimularon la formación del DAG observándose la máxima generación en presencia de Triton X-100 al 0,1%, concentración que incrementó la generación de DAG en un 330% con respecto al control. Por otra parte, el agregado de los iones Ca2+ (2 mM) y Mg2+ (1 mM) exógenos inhibió la formación de DAG en un 73% y en un 50% respectivamente. En presencia de etanol (2%) evaluamos la reacción de transfosfatidilación catalizada por la PLD por la cual se genera fosfatidiletanol (PEth) en lugar de PA. Dado que la PAP2 no puede hidrolizar el PEth al incluir este alcohol primario en la reacción enzimática pudimos medir la generación de DAG que proviene exclusivamente de la vía de la PC-PLC. Mediante la utilización de etanol, del inhibidor de la PC-PLC (D609) y del DL-propranolol como inhibidor de la PAP2, demostramos que ambas vías enzimáticas (PC-PLC y PLD) participan en la generación de DAG. Luego de 20 min de incubación la vía de la PLD aportó el 40% del DAG generado mientras que la PC-PLC fue responsable del 60% del DAG generado. Este mismo aporte porcentual se observó en los sinaptosomas provenientes de ratas seniles. Los ensayos cinéticos realizados en presencia de etanol permitieron determinar la constante aparente de Michaelis-Menten (KM) y velocidad máxima (Vmáx) para la PC-PLC sinaptosomal, las cuales fueron de 350 μM y 3.7 nmol DAG x (mg proteína x h)-1 respectivamente. Ensayos de Western blot utilizando un suero policlonal anti-PC-PLC de Bacillus cereus evidenciaron la presencia de dos bandas muy próximas, de un peso molecular cercano a 66 kDa, tanto en las terminales sinápticas de ratas adultas como de ratas seniles. La generación de DAG se evaluó en la fracción de membrana plasmática sinaptosomal (SPM), en esta fracción la formación de DAG fue un 73% mayor respecto a la generación en los sinaptosomas mientras que en la fracción soluble la hidrólisis de la PC a DAG fue prácticamente indetectable. Mediante la utilización de etanol demostramos que la actividad específica de la PC-PLC es un 80% mayor en la fracción SPM que en los Syn. Estudiamos también la hidrólisis de la PC en la fracción de membrana resistente a detergentes (DRMs). Esta fracción (aislada por el tratamiento de los Syn de ratas adultas y seniles con Triton X-100 1% a 4C) presentó características de rafts de membrana, ya que se encontró enriquecida en esfingomielina y colesterol, así como también en proteínas marcadoras de rafts como la caveolina y c-Src. La fracción DRM presentó además un perfil proteico diferencial al de los Syn y un enriquecimiento en la isoforma PLD1, mientras que ensayos de Slot blot mostraron que la PC-PLC se localiza en ambas fracciones. También en las DRMs se observó la generación de DAG por hidrólisis de la PC, sin embargo la presencia de etanol en el ensayo no disminuyó la formación de DAG. Estos resultados indicaron que, a pesar de encontrarse enriquecida en la isoforma PLD1, no se detectó actividad de la PLD en la fracción resistente a detergentes. Por el contrario, la actividad de la PC-PLC fue aproximadamente un 60% mayor en las DRMs con respecto a los Syn. En la segunda parte de la tesis estudiamos el efecto del estrés oxidativo inducido por Fe2+ en la hidrólisis de la PC. La incubación de los Syn de ratas adultas con FeSO4 (50μM) generó un marcado aumento en la peroxidación lipídica que se observó a partir de tiempos cortos de incubación. También se afectó la funcionalidad mitocondrial y la integridad de la membrana plasmática, aunque estos dos parámetros se vieron afectados luego de 60 min de incubación con el agente inductor de la injuria oxidativa. El tratamiento de los Syn de ratas adultas con el hierro provocó una mayor generación de DAG por hidrólisis de la PC, este aumento fue del 77, 50 y 65% luego de 5, 30 y 60 min de preincubación respectivamente. En forma contraria, la generación de ácidos grasos libres (AGL) se inhibió en un 50% luego de 5 y de 60 min de preincubación con el hierro. Evaluando la generación de DAG en presencia de etanol (actividad de la PC-PLC) y la formación de PEth como marcador de la actividad de la PLD, demostramos que ambas vías enzimáticas contribuyen a la formación de DAG bajo condiciones de estrés oxidativo. El mismo efecto en la generación de DAG y AGL se observó en las terminales sinápticas de ratas seniles. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de peroxidación lipídica en los Syn de ratas seniles con respecto a las adultas. La generación de DAG en los Syn de ratas adultas fue independiente de la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y de la actividad de tirosinas quinasas. Por otra parte, la inhibición de la fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2-PLC) disminuyó significativamente la generación de DAG en los Syn expuestos al Fe2+, sin embargo este efecto no fue mediado por la actividad de las PKCs. La inhibición de las vías metabolizadoras, DAGK y DAG lipasa (DAGL), tampoco modificó los niveles de DAG generados tanto en la condición control como en la experimental, esto se observó en los Syn de ratas adultas y seniles. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez la presencia de la PC-PLC en las terminales sinápticas de la corteza cerebral de rata. Nuestros hallazgos constituyen el primer indicio acerca de la activación de las vías de la PC-PLC y de la PLD en condiciones de estrés oxidativo en las terminales sinápticas, representando el punto de partida para el estudio del rol de estas vías de generación de segundos mensajeros lipídicos en los procesos neurodegenerativos.

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