Lípidos con ácidos grasos poliinsaturados de larga y muy larga cadena en células del epitelio seminífero y espermatozoides

El objetivo de esta tesis fue el de reunir información sobre la bioquímica de los lípidos con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de larga y muy larga cadena (VLCPUFA) que abundan en células del tracto reproductor masculino. Utilizando ratas adultas como modelo, se investigaron tres sistemas: el te...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Oresti, Gerardo Martín
Otros Autores: Aveldaño, Marta Isabel
Formato: tesis doctoral
Lenguaje:Español
Publicado: 2009
Materias:
lípidos
ácidos grasos
células
espermatozoides
Acceso en línea:http://repositoriodigital.uns.edu.ar/handle/123456789/2007
Aporte de:
Repositorio Institucional Universidad Nacional del Sur (UNS) de Universidad Nacional del Sur
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description El objetivo de esta tesis fue el de reunir información sobre la bioquímica de los lípidos con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) de larga y muy larga cadena (VLCPUFA) que abundan en células del tracto reproductor masculino. Utilizando ratas adultas como modelo, se investigaron tres sistemas: el tejido testicular in vivo, influido por agentes que afectan la espermatogénesis, células germinales en dos etapas distintas de su diferenciación, aisladas a partir del epitelio seminífero, y espermatozoides maduros, aislados de la región caudal del epidídimo. La primera parte se centró en buscar evidencia que permitiera relacionar los lípidos en estudio con los tipos celulares presentes en los túbulos seminíferos, células germinales y de Sertoli. Se estudiaron los efectos in vivo de dos agentes que se sabe inducen la muerte de células germinales: la ciclofosfamida y la exposición a los rayos X. Algunos de los efectos tempranos de la muerte celular sobre los lípidos en estudio pudieron observarse luego de la administración de una dosis única de ciclofosfamida, mientras que las consecuencias a largo plazo de tal muerte pudieron verse claramente varias semanas después de la exposición del testículo a los rayos X. La pérdida de la línea germinal se correlacionó con una masiva pérdida del peso testicular (húmedo y seco), del fósforo lipídico y del colesterol libre, que tomó unas 6 semanas. Esto se debió a una conjunción de efectos sobre las células: 1) la muerte por apoptosis de células indiferenciadas, que fueron muy radiosensibles porque estaban en activa división al momento de irradiar (desapareciendo en un día o dos y contribuyendo, más tarde, a la despoblación del testículo); 2) aquéllas que no se estaban dividiendo en ese momento pero cuyo genoma fue dañado por los rayos X de forma tal que murieron más tarde (1-4 semanas); 3) aquéllas más diferenciadas que ya no se estaban dividiendo y no se afectaron (radiorresistentes), por lo que continuaron su diferenciación al ritmo normal de la espermatogénesis hasta que estuvieron listas para salir del testículo en forma de espermatozoides (6 semanas). Después de la 6 en adelante, y hasta la semana 30, las células de Sertoli eran las únicas pobladoras de los túbulos seminíferos. La pérdida selectiva y gradual de células de la línea germinal fue concomitante con la disminución del contenido de los glicerofosfolípidos (GPL) ricos en 22:5n-6, incluyendo en ello a los plasmalógenos, y de las esfingomielinas (SM) ricas en VLCPUFA. Estas últimas estuvieron constituidas por especies conteniendo VLCPUFA normales o no hidroxilados (como el 28:4n-6, 30:5n-6 y 32:5n-6) y VLCPUFA 2-hidroxilados (como el 2-OH 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 y 2-OH 32:5n-6). Después de la irradiación, las especies de SM (y de ceramida, Cer) que contienen VLCPUFA desaparecieron 2 semanas antes que las que tienen 2-OH VLCPUFA. En la ausencia de células germinales, los GPL testiculares tenían 20:4n-6 como su PUFA principal, y las SM contenían principalmente AG saturados como el 16:0, revelando la composición de los GPL y las SM de las células somáticas que sobrevivieron a la irradiación, incluyendo en este grupo a las células de Sertoli. A diferencia de los GPL, los triacilgliceroles (TAG) ricos en 22:5n-6 se mantuvieron prácticamente sin cambio durante las primeras 4 semanas, para caer drásticamente en el estrecho período entre las semanas 4 y 6 post-irradiación. Una tinción específica para gotas de lípidos neutros (Nile Red) en cortes de tejido, tanto en controles no irradiados como a la semana 4 (pero ya no más a partir de la semana 6) post-irradiación, mostró la presencia de microgotas lipídicas en las espermátidas tardías, así como en los cuerpos residuales (CR) que se desprenden de ellas. Esto sugirió que estas gotitas debían contener los TAG mencionados, cuya cantidad disminuyó abruptamente al diferenciarse las últimas espermátidas y abandonar el testículo en forma de espermatozoides. Esto fue confirmado más tarde cuando los CR mostraron ser particularmente ricos en este tipo de TAG. Los minoritarios triglicéridos con una unión éter (TUE), ricos en 22:5n-6 y VLCPUFA de 24-32 carbonos, se distinguieron de los TAG en que en las primeras semanas acumularon VLCPUFA y luego 22:5n-6. Eventualmente, ambos tipos de PUFA desaparecieron de los TUE testiculares. Más tarde se confirmó que estos lípidos no son componentes de las células germinales. Los ésteres de colesterol (EC) se asemejaron a los TUE en que inicialmente incrementaron sus VLCPUFA (28:5n-6, 30:5n-6) pero luego empezaron a acumular otros ácidos grasos, especialmente 22:5n-6. A la semana 6 post-irradiación los EC eran los únicos lípidos cuya cantidad había alcanzado valores varias veces mayor a la de los controles no irradiados. Dado que ya no había células germinales, era claro que esos EC se acumulaban en las células de Sertoli. A la semana 6, el Nile Red reveló la presencia de abundantes gotas lipídicas grandes en la zona adluminal de los túbulos seminíferos, sugiriendo que esas gotas eran los sitios celulares en que se acumulaban los EC. Teniendo en cuenta que las células germinales que mueren por apoptosis son fagocitadas por las células de Sertoli, éstas deben procesar los GPL ricos en 22:5n-6 y el colesterol provenientes de aquéllas, lo que sugiere que los EC se forman en ellas esterificando el colesterol libre con ácidos grasos liberados desde los GPL. En la segunda parte de esta tesis los lípidos de células germinales puras aisladas, espermatocitos en paquiteno (EP) de la meiosis y espermátidas redondas (ER), dos estadios bien definidos de la diferenciación, más una fracción conteniendo los cuerpos residuales (CR) que se desprenden de formas más maduras, elongadas, de las espermátidas, proveyeron varias respuestas y abrieron algunas nuevas preguntas sobre sus especiales lípidos. Por una parte, estos resultados confirmaron las conclusiones a que habíamos arribado por inferencia a partir de los estudios in vivo sobre la distribución celular de los varios lípidos en estudio. Por otra, proveyeron nuevos datos que pusieron en evidencia que, así como lo hacen los GPL, las Cer y las SM con VLCPUFA sufren cambios relevantes con la diferenciación de las células germinales. Los TAG fueron los únicos lípidos neutros en cantidades apreciables en ambos tipos celulares, así como en los cuerpos residuales, donde fueron especialmente abundantes, mientras que los TUE y los EC con PUFA y VLCPUFA fueron casi indetectables en cualquiera de las tres fracciones, reforzando la conclusión de que estos lípidos pertenecen a las células de Sertoli. Conforme avanzó la diferenciación de EP a ER, los GPL incluyendo a los plasmalógenos se volvieron progresivamente más pobres en 20:4n-6 y más ricos en 22:5n-6. Los dos tipos celulares estudiados, EP y ER, contuvieron SM y Cer con proporciones asombrosamente altas de VLCPUFA. Los VLCPUFA normales (no hidroxilados) predominaron ampliamente en la SM y Cer de los EP, mientras los 2-HO VLCPUFA lo hicieron en la SM y Cer de las ER. Esto evidenció que la formación de estas últimas especies moleculares es una característica estrechamente asociada a la diferenciación de las células germinales. Esta convicción se reforzó cuando los espermatozoides epididimales mostraron que sus SM y Cer contenían una proporción de 2-OH VLCPUFA aún mayor que las de las ER. Durante la progresión EP �� �� ER �� �� espermatozoides, el 28:4n-6 disminuyó menos que el 30:5n-6, mientras que por el contrario el 2-HO 30:5n-6 aumentó más que el 2-HO 28:4n-6 en ambos lípidos. La SM espermática tuvo al 28:4n-6 como principal y casi único VLCPUFA, y al al 2-OH 30:5n-6 como principal 2-OH VLCPUFA. Llamativamente, los CR casi no tenían Cer, y su SM sólo contuvo 2-HO VLCPUFA. En los espermatozoides de rata aislados de la región caudal del epidídimo se estudiaron las principales clases de los GPL (incluyendo plasmalógenos) y sus PUFA, así como la SM y Cer y sus VLCPUFA, para determinar su distribución entre la cabeza y la cola de las gametas. Más del 80% de los GPL se localizó en la gran cola, mientras que toda la SM con VLCPUFA y 2-HO VLCPUFA se concentró en la pequeña cabeza. La reacción SM �� Cer resultó ser altamente sensible y activa en los espermatozoides. Mediante el agregado de EDTA a los medios de aislamiento esta conversión fue inhibida, determinando así que es estrictamente dependiente de iones bivalentes, principalmente calcio. Cuando se incubaron los espermatozoides en un medio que por contener C2+bicarbonato y albúmina promueve la capacitación y, en parte, la reacción acrosomal, un porcentaje importante de los GPL y casi toda la SM fueron perdidas por las gametas. La SM con 28:4n-6, así como las SM con 2-OH VLCPUFA, propias de la cabeza espermática, se hidrolizaron para generar cantidades casi equivalentes de las correspondientes Cer. Un hallazgo sorprendente fue que mientras la cola del espermatozoide carecía completamente de SM con VLCPUFA (no hidroxilados o hidroxilados), era en cambio rica en Cer con 2-OH VLCPUFA (2-HO 28:4n-6, 2-OH 30:5n-6 y 2-OH 32:5n-6). Estos eran, en similares proporciones, los mismos VLCPUFA que aparecían en las abundantes Cer de las espermátidas redondas. Mientras los principales GPL (en especial los de colina) se remodelan en el espermatozoide a medida que progresa su maduración en el epidídimo, cambiando sus principales subclases y sus PUFA, tanto la SM con 2-OH VLCPUFA (destinada a la cabeza), como la Cer con 2-OH VLCPUFA (destinada a la cola espermática), se generan ambas en el testículo, acompañando al espermatozoide casi sin cambios desde sus primeros esbozos en el epitelio seminífero (espermátida redonda) hasta su madurez casi total después de su pasaje a través del epitelio epididimal. Las posibles funciones que cumplen estas inusuales Cer en la cola espermática serán el objeto de futuros estudios.

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