Caracterización estructural y funcional de la hemocianina de Pomacea canaliculata y su participación en el sistema inmune de moluscos gasterópodos

Pomacea canaliculata, Lamarck 1822 (Gastropoda, Ampulariidae) es una especie dulceacuícola nativa de Sudamérica, que se ha convertido en invasora en diversas regiones del mundo, generando perjuicios a nivel económico y medioambiental, y actuando como vector del nematodo Angiostrongylus cantonensis,...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Chiumiento, Ignacio Rafael
Otros Autores:	Heras, Horacio
Formato:	Tesis Tesis de doctorado
Lenguaje:	Español
Publicado:	2024
Materias:	Ciencias Naturales Gasterópodo Molusco Pigmento respiratorio Inmunidad innata Inmunoestimulante
Acceso en línea:	http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/176561 https://doi.org/10.35537/10915/176561
Aporte de:	SEDICI (UNLP) de Universidad Nacional de La Plata

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Su rol en la fisiología de invertebrados no se limita al intercambio gaseoso, sino que también participa de procesos como la hemostasia, el transporte de lípidos y el mantenimiento de la presión oncótica. Destaca su rol en la inmunidad innata, donde hemocianinas de diversas especies han sido estudiadas por su capacidad de actuar como fenoloxidasas durante la melanización y liberar péptidos antimicrobianos. Adicionalmente, las hemocianinas de moluscos han adquirido interés por su potencial biomédico como compuestos inmunoestimulantes, propiedad que se ha asociado con su gran tamaño y patrón de glicosilación. Hasta el momento, las hemocianinas evaluadas para este uso provienen de especies con biodisponibilidad reducida, principalmente la hemocianina del gasterópodo marino Megathura crenulata (KLH), que se emplea como adyuvante en diferentes protocolos de inmunización y en terapias antitumorales contra el cáncer de vejiga con recidivas.El presente trabajo de tesis se propone contribuir al conocimiento sobre la estructura y función de las hemocianinas de moluscos, así como su potencial aplicación. Para ello se estudió la hemocianina de Pomacea canaliculata (PcH), iniciando una caracterización de su estructura y propiedades biofisicoquímicas, su rol como molécula efectora del sistema inmune y su capacidad inmunogénica sobre vertebrados.Se optimizó un protocolo para la obtención de PcH en grandes cantidades y con un alto grado de pureza. Seguidamente, se determinaron las secuencias aminoacídicas internas de la proteína, lo que permitió obtener las secuencias completas empleando el transcriptoma de la especie. A partir de ellas, se realizó un análisis in silico donde se pudo determinar peso molecular, péptido señal, punto isoeléctrico, coeficiente de extinción molar, dominios conservados y sitios de glicosilación para PcH. Adicionalmente, se investigó su estructura cuaternaria, resolviéndose un modelo 3D por criomicroscopía electrónica de 4,4 Å y confirmando que PcH presenta la estructura típica de las hemocianinas del tipo KLH. La resolución lograda permitió determinar interacciones estabilizantes de la estructura cuaternaria no descriptas previamente para este tipo de hemocianinas, así como la ubicación de glicanos N-ligados. La cercanía de estos elementos con los sitios activos sugiere una participación en los cambios conformacionales ocurridos durante el efecto cooperativo. Se evaluó la estabilidad frente a cambios de temperatura y pH, encontrándose que PcH es estable hasta los 60 °C y a valores de pH entre 4 y 10. Asimismo, se observó que su afinidadpor el O2 disminuía por encima de los 24 °C, y que presenta asociación con lípidos, principalmente fosfolípidos.En cuanto a su participación en la inmunidad innata, se encontró que PcH podría estar involucrada en una serie de mecanismos defensivos frente a patógenos. Así, se detectó actividad fenoloxidasa intrínseca baja, pero inducible por tratamientos proteolíticos limitados, que llevarían a un remodelado capaz de aumentar la accesibilidad de los sustratos al sitio activo. Un estudio in silico de PcH reveló la presencia de varios sitios de clivaje proteolítico accesibles, lo cual fue verificado experimentalmente. En paralelo, se evaluó la capacidad de PcH para generar péptidos antimicrobianos, mediante análisis de su secuencia y posterior síntesis de los mejores candidatos. Éstos fueron evaluados in vitro, confirmando su actividad antimicrobiana. Se generaron modelos ab initio de estos péptidos, y se mapearon en el modelo de PcH, revelando que la mayoría de ellos eran accesibles para ser liberados por ataque proteolítico. Sumado a ello, se encontró que PcH es capaz de aglutinar bacterias y que en su secuencia alberga dominios tipo-inmunoglobulina bien expuestos, frecuentemente asociados con el reconocimiento y aglutinación de patógenos, algo nunca antes descripto en hemocianinas de gasterópodos.Por último, se estudió la capacidad inmunoestimulante de PcH, analizando su efecto in vitro sobre una línea de monocitos humanos THP-1 e in vivo sobre ratones C57BL/6JLAE. Se encontró que PcH provoca un aumento en la secreción de citoquinas proinflamatorias por parte de macrófagos ya diferenciados y que este efecto se pierde tras deglicosilar a la proteína. Al indagar sobre el perfil de glicosilación, se halló que PcH porta oligosacáridos N-ligados del tipo alta manosa, estructuras de tipo híbrido y glicanos compatibles con antígeno T, similar a lo observado para KLH. A su vez, ensayos con suero policlonal anti-PcH demostraron la ausencia de reactividad cruzada con otras hemocianinas de moluscos, dando cuenta de características antigénicas particulares. En adición, cuando PcH fue incubada con monocitos produjo un aumento en la adhesión celular y cambios morfológico-metabólicos compatibles con un efecto diferenciador. Esto sumado al estudio de la expresión de marcadores de macrófagos, confirmó que PcH induce la diferenciación monocito-macrófago, en un proceso que parece derivar hacia la formación de macrófagos M1, aquéllos asociados a respuestas de tipo proinflamatoria. Finalmente, al comparar la respuesta humoral desencadenada por PcH con aquélla generada por KLH, se observaron niveles equivalentes. De este modo, PcH se plantea como nuevo agente inmunoestimulante, con un método de purificación sencillo a partir de una especie dulceacuícola con buena biodisponibilidad, todo lo cual refuerza la importancia de su estudio y alienta a continuar investigando en aras de una potencial aplicación biomédica.
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En este contexto, cobra interés el estudio de su biología, y en particular, de las adaptaciones a nivel bioquímico que podrían explicar su éxito reproductivo. Entre ellas destacan las asociadas con su carácter anfibio, donde la hemocianina, pigmento respiratorio que constituye la proteína mayoritaria de la hemolinfa, jugaría un papel central.Las hemocianinas de moluscos cuentan con una estructura oligomérica compleja, lo que les permite alcanzar tamaños considerables, siendo una de las proteínas más grandes de la naturaleza. Su rol en la fisiología de invertebrados no se limita al intercambio gaseoso, sino que también participa de procesos como la hemostasia, el transporte de lípidos y el mantenimiento de la presión oncótica. Destaca su rol en la inmunidad innata, donde hemocianinas de diversas especies han sido estudiadas por su capacidad de actuar como fenoloxidasas durante la melanización y liberar péptidos antimicrobianos. Adicionalmente, las hemocianinas de moluscos han adquirido interés por su potencial biomédico como compuestos inmunoestimulantes, propiedad que se ha asociado con su gran tamaño y patrón de glicosilación. Hasta el momento, las hemocianinas evaluadas para este uso provienen de especies con biodisponibilidad reducida, principalmente la hemocianina del gasterópodo marino Megathura crenulata (KLH), que se emplea como adyuvante en diferentes protocolos de inmunización y en terapias antitumorales contra el cáncer de vejiga con recidivas.El presente trabajo de tesis se propone contribuir al conocimiento sobre la estructura y función de las hemocianinas de moluscos, así como su potencial aplicación. Para ello se estudió la hemocianina de Pomacea canaliculata (PcH), iniciando una caracterización de su estructura y propiedades biofisicoquímicas, su rol como molécula efectora del sistema inmune y su capacidad inmunogénica sobre vertebrados.Se optimizó un protocolo para la obtención de PcH en grandes cantidades y con un alto grado de pureza. Seguidamente, se determinaron las secuencias aminoacídicas internas de la proteína, lo que permitió obtener las secuencias completas empleando el transcriptoma de la especie. A partir de ellas, se realizó un análisis in silico donde se pudo determinar peso molecular, péptido señal, punto isoeléctrico, coeficiente de extinción molar, dominios conservados y sitios de glicosilación para PcH. Adicionalmente, se investigó su estructura cuaternaria, resolviéndose un modelo 3D por criomicroscopía electrónica de 4,4 Å y confirmando que PcH presenta la estructura típica de las hemocianinas del tipo KLH. La resolución lograda permitió determinar interacciones estabilizantes de la estructura cuaternaria no descriptas previamente para este tipo de hemocianinas, así como la ubicación de glicanos N-ligados. La cercanía de estos elementos con los sitios activos sugiere una participación en los cambios conformacionales ocurridos durante el efecto cooperativo. Se evaluó la estabilidad frente a cambios de temperatura y pH, encontrándose que PcH es estable hasta los 60 °C y a valores de pH entre 4 y 10. Asimismo, se observó que su afinidadpor el O2 disminuía por encima de los 24 °C, y que presenta asociación con lípidos, principalmente fosfolípidos.En cuanto a su participación en la inmunidad innata, se encontró que PcH podría estar involucrada en una serie de mecanismos defensivos frente a patógenos. Así, se detectó actividad fenoloxidasa intrínseca baja, pero inducible por tratamientos proteolíticos limitados, que llevarían a un remodelado capaz de aumentar la accesibilidad de los sustratos al sitio activo. Un estudio in silico de PcH reveló la presencia de varios sitios de clivaje proteolítico accesibles, lo cual fue verificado experimentalmente. En paralelo, se evaluó la capacidad de PcH para generar péptidos antimicrobianos, mediante análisis de su secuencia y posterior síntesis de los mejores candidatos. Éstos fueron evaluados in vitro, confirmando su actividad antimicrobiana. Se generaron modelos ab initio de estos péptidos, y se mapearon en el modelo de PcH, revelando que la mayoría de ellos eran accesibles para ser liberados por ataque proteolítico. Sumado a ello, se encontró que PcH es capaz de aglutinar bacterias y que en su secuencia alberga dominios tipo-inmunoglobulina bien expuestos, frecuentemente asociados con el reconocimiento y aglutinación de patógenos, algo nunca antes descripto en hemocianinas de gasterópodos.Por último, se estudió la capacidad inmunoestimulante de PcH, analizando su efecto in vitro sobre una línea de monocitos humanos THP-1 e in vivo sobre ratones C57BL/6JLAE. Se encontró que PcH provoca un aumento en la secreción de citoquinas proinflamatorias por parte de macrófagos ya diferenciados y que este efecto se pierde tras deglicosilar a la proteína. Al indagar sobre el perfil de glicosilación, se halló que PcH porta oligosacáridos N-ligados del tipo alta manosa, estructuras de tipo híbrido y glicanos compatibles con antígeno T, similar a lo observado para KLH. A su vez, ensayos con suero policlonal anti-PcH demostraron la ausencia de reactividad cruzada con otras hemocianinas de moluscos, dando cuenta de características antigénicas particulares. En adición, cuando PcH fue incubada con monocitos produjo un aumento en la adhesión celular y cambios morfológico-metabólicos compatibles con un efecto diferenciador. Esto sumado al estudio de la expresión de marcadores de macrófagos, confirmó que PcH induce la diferenciación monocito-macrófago, en un proceso que parece derivar hacia la formación de macrófagos M1, aquéllos asociados a respuestas de tipo proinflamatoria. Finalmente, al comparar la respuesta humoral desencadenada por PcH con aquélla generada por KLH, se observaron niveles equivalentes. De este modo, PcH se plantea como nuevo agente inmunoestimulante, con un método de purificación sencillo a partir de una especie dulceacuícola con buena biodisponibilidad, todo lo cual refuerza la importancia de su estudio y alienta a continuar investigando en aras de una potencial aplicación biomédica. Doctor en Ciencias Naturales Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Naturales y Museo Tesis Tesis de doctorado http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International (CC BY-NC-SA 4.0) application/pdf

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