Efecto de estresores naturales y antropogénicos (insecticidas) sobre diferentes estructuras lipídicas y metabolismo oxidativo de arañas

Las arañas (Arthropoda: Araneae) son el orden más diverso dentro de la Clase Arachnida. Se encuentran presentes en todos los ecosistemas terrestres y se destacan por su voraz hábito depredador generalista, principalmente sobre insectos. Esta formidable capacidad para controlar las poblaciones de esp...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Molina, Gabriel
Otros Autores: Laino, Aldana
Formato: Tesis Tesis de doctorado
Lenguaje:Español
Publicado: 2024
Materias:
Ciencias Naturales
Araneae
Análisis bioquímico
Estrés Oxidativo
Lípidos
Acceso en línea:http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/175732
https://doi.org/10.35537/10915/175732
Aporte de:
SEDICI (UNLP) de Universidad Nacional de La Plata
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description Las arañas (Arthropoda: Araneae) son el orden más diverso dentro de la Clase Arachnida. Se encuentran presentes en todos los ecosistemas terrestres y se destacan por su voraz hábito depredador generalista, principalmente sobre insectos. Esta formidable capacidad para controlar las poblaciones de especies potencialmente destructivas para la agricultura convierte a las arañas en candidatas para ser importantes controladores biológicos de plagas. Sin embargo, los medios químicos convencionales empleados para proteger los cultivos, suponen un riesgo para los organismos no blanco. Como modelo biológico de arañas para esta tesis, se eligió a Polybetes pythagoricus (Sparassidae), una araña autóctona de Sudamérica, distribuida en el centro-norte del país. Esta especie resulta un adecuado modelo para ensayos bioquímicos debido a su tamaño, abundancia, facilidad de captura, manipulación y mantenimiento en laboratorio. El clorpirifos es un insecticida organofosforado de amplio espectro que, aunque ha generado preocupación por su potencial persistencia en el ambiente y evidencia de toxicidad para muchas especies incluida la humana, sigue siendo utilizado en muchos países del mundo para el control de plagas en agroecosistemas, incluido Argentina. Una vez liberado al ambiente, es factible que los organismos puedan detectar las áreas contaminadas con insecticidas y evitarlas a partir de cambios en su comportamiento. Para evaluar la capacidad de P. pythagoricus de alterar su comportamiento exploratorio a causa de este insecticida, se realizaron ensayos en los que se registraron, durante 4 h, los movimientos de adultos en presencia de superficies expuestas a clorpirifos. Se observó que P. pythagoricus es capaz de reconocer y evitar superficies contaminadas. Sin embargo, debido a los usuales medios de aplicación, aún es probable que este plaguicida alcance a los individuos. La cutícula de los artrópodos es la primer defensa contra las condiciones adversas y sustancias xenobióticas. Su capa más externa, la epicutícula, se ha descripto como una potencial barrera ante los insecticidas, debido a su contenido de hidrocarburos. Los hidrocarburos de la epicutícula de P. pythagoricus se caracterizaron mediante cromatografía gaseosa y espectrometría de masas, mostrando una composición rica en hidrocarburos de cadena larga, la que implica un posible rol en la protección ante la internalización de insecticidas. Pese a lo expuesto, la internalización de los insecticidas es una posibilidad. Una consecuencia general de la intoxicación con estos compuestos, incluso en dosis subletales, es la sobreproducción de especies reactivas del oxígeno, lo que puede provocar estrés oxidativo y por lo tanto daño en las biomoléculas, que particularmente en lípidos, se evidencia como peroxidación lipídica. Uno de los principales mecanismos que existen como defensa ante lo anterior, es el sistema antioxidante enzimático. Se plantearon ensayos de exposición tópica a una dosis de campo de clorpirifos, con tiempos de 6, 24 y 48 h, sobre P. pythagoricus adultas. Posteriormente a los ensayos, se disecó el divertículo intestinal, órgano clave en el metabolismo de las arañas. Sobre el homogenato de este órgano se realizaron mediciones de actividad de varias enzimas: superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, glutatión-S-transferasa; y se midió la concentración de malonaldehido (como evidencia de peroxidación lipídica), y la actividad del biomarcador de efecto de organofosforados, la enzima acetilcolinesterasa. Se observó un cambio significativo en la actividad de catalasa, que fue más alta a las 6 h, mientras que la actividad de superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa aumentó significativamente a las 24 h. La peroxidación lipídica aumentó a las 6 h, pero disminuyó a las 48 h. Una potencial consecuencia del estrés oxidativo es el daño a nivel de los tejidos. Para estudiar esta posibilidad sobre el divertículo intestinal, se expusieron adultos a dosis de campo de clorpirifos durante 24 h y se realizaron preparados histológicos teñidos con hematoxilina-eosina. Se observó necrosis desde las 24 h en el divertículo intestinal. Existen otros tipos de insecticidas para los que, a diferencia de los organofosforados, se tiene evidencia de ser relativamente más benignos para los enemigos naturales. Por lo cual, se realizó exposición tópica de 48 h a la dosis de campo de abamectina, una avermectina de uso común como insecticida en agricultura, sobre P. pythagoricus y se cuantificaron las actividades de las enzimas catalasa, como parte del sistema antioxidante y acetilcolinesterasa, como biomarcador de efecto. Además, se cuantificó la peroxidación lipídica para verificar daño oxidativo. No se probaron efectos significativos de la abamectina para ninguna de estas variables. Los plaguicidas son una fuente de estrés de origen antropogénico, pero todo organismo debe enfrentarse también a fluctuaciones de la temperatura ambiental, que son de especial relevancia para los organismos ectotermos como las arañas. Las membranas son estructuras fundamentales de toda célula, cuya función biológica depende de su viscosidad. Este parámetro es afectado por la temperatura y por la composición lipídica. La hipótesis de homeoviscosidad adaptativa propone que, ante aumentos de la temperatura ambiental, la composición lipídica, y principalmente de ácidos grasos de las membranas, se modifica. Además, cambios en los porcentajes de fosfolípidos y colesterol son ajustes frecuentemente observados. Para estudiar como estos mecanismos operan en P. pythagoricus, se aclimataron adultos y juveniles durante 20 días a 1, 4, 10, 25 y 35 °C. Los lípidos totales del divertículo intestinal y el tejido muscular se extrajeron y se caracterizaron por cromatografía en capa fina acoplada a detector de ionización por llama. A partir de los lípidos totales se obtuvieron por saponificación y esterificación los ésteres metílicos de ácidos grasos, cuyos porcentajes se analizaron por cromatografía gaseosa acoplada a detector de ionización por llama. Los resultados indicaron que existieron variaciones lipídicas entre las diferentes temperaturas. Se observaron cambios en colesterol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y triacilgliceroles. Para el caso de los ácidos grasos, a menores temperaturas se observó un aumento de ácidos grasos insaturados (16:1, 18:1) y una disminución concomitante de ácidos grasos saturados (17:0 y 20:0). Múltiples estresores pueden presentarse simultáneamente en el ambiente natural, por lo que entender cómo sus efectos se combinan para impactar sobre los individuos, se vuelve necesario a la hora de evaluar el riesgo sobre los organismos de interés como las arañas. La temperatura como condición ambiental, es por sí misma capaz de provocar estrés oxidativo, lo que podría agravarse si los organismos se exponen además a un segundo factor de estrés, como un insecticida. Para este estudio se aclimataron adultos de P. pythagoricus a 1, 25 y 35 °C durante 20 días, luego se los expuso tópicamente por 24 h a la dosis de campo de clorpirifos y se cuantificaron en divertículo intestinal la actividad de las enzimas del sistema antioxidante y las especies reactivas del oxígeno totales. Como resultado, no se encontró interacción entre las dos fuentes de estrés. Pero si se observó que la temperatura afecta levemente a la catalasa, glutatión-S-transferasa y superóxido dismutasa. Esta última, a su vez se observó influenciada por la exposición al clorpirifos. También se cuantificaron las sustancias crioprotectoras glicerol y glucosa, en divertículo intestinal, cuyos niveles se mantuvieron constantes entre las diferentes temperaturas. Finalmente, de los ensayos realizados para esta tesis, se puede concluir que P. pythagoricus, como modelo de araña, puede ser afectada por una fuente de estrés antropogénico como el insecticida clorpirifos, en dosis que son usadas para la agricultura. Se probó que esta sustancia es capaz de alterar su comportamiento exploratorio y de inducir efectos adversos subletales, evidenciados por los cambios en la actividad de enzimas antioxidantes y marcadores de estrés oxidativo como peroxidación lipídica y daño histológico. A su vez, se cuantificó la variación en la composición lipídica ocasionada por la aclimatación a distintas temperaturas. Por último, no se encontró evidencia de que ambas fuentes de estrés interactuaran para agravar el efecto sobre el sistema antioxidante en las condiciones que fueron ensayadas.
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Sin embargo, los medios químicos convencionales empleados para proteger los cultivos, suponen un riesgo para los organismos no blanco. Como modelo biológico de arañas para esta tesis, se eligió a Polybetes pythagoricus (Sparassidae), una araña autóctona de Sudamérica, distribuida en el centro-norte del país. Esta especie resulta un adecuado modelo para ensayos bioquímicos debido a su tamaño, abundancia, facilidad de captura, manipulación y mantenimiento en laboratorio. El clorpirifos es un insecticida organofosforado de amplio espectro que, aunque ha generado preocupación por su potencial persistencia en el ambiente y evidencia de toxicidad para muchas especies incluida la humana, sigue siendo utilizado en muchos países del mundo para el control de plagas en agroecosistemas, incluido Argentina. Una vez liberado al ambiente, es factible que los organismos puedan detectar las áreas contaminadas con insecticidas y evitarlas a partir de cambios en su comportamiento. Para evaluar la capacidad de P. pythagoricus de alterar su comportamiento exploratorio a causa de este insecticida, se realizaron ensayos en los que se registraron, durante 4 h, los movimientos de adultos en presencia de superficies expuestas a clorpirifos. Se observó que P. pythagoricus es capaz de reconocer y evitar superficies contaminadas. Sin embargo, debido a los usuales medios de aplicación, aún es probable que este plaguicida alcance a los individuos. La cutícula de los artrópodos es la primer defensa contra las condiciones adversas y sustancias xenobióticas. Su capa más externa, la epicutícula, se ha descripto como una potencial barrera ante los insecticidas, debido a su contenido de hidrocarburos. Los hidrocarburos de la epicutícula de P. pythagoricus se caracterizaron mediante cromatografía gaseosa y espectrometría de masas, mostrando una composición rica en hidrocarburos de cadena larga, la que implica un posible rol en la protección ante la internalización de insecticidas. Pese a lo expuesto, la internalización de los insecticidas es una posibilidad. Una consecuencia general de la intoxicación con estos compuestos, incluso en dosis subletales, es la sobreproducción de especies reactivas del oxígeno, lo que puede provocar estrés oxidativo y por lo tanto daño en las biomoléculas, que particularmente en lípidos, se evidencia como peroxidación lipídica. Uno de los principales mecanismos que existen como defensa ante lo anterior, es el sistema antioxidante enzimático. Se plantearon ensayos de exposición tópica a una dosis de campo de clorpirifos, con tiempos de 6, 24 y 48 h, sobre P. pythagoricus adultas. Posteriormente a los ensayos, se disecó el divertículo intestinal, órgano clave en el metabolismo de las arañas. Sobre el homogenato de este órgano se realizaron mediciones de actividad de varias enzimas: superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, glutatión-S-transferasa; y se midió la concentración de malonaldehido (como evidencia de peroxidación lipídica), y la actividad del biomarcador de efecto de organofosforados, la enzima acetilcolinesterasa. Se observó un cambio significativo en la actividad de catalasa, que fue más alta a las 6 h, mientras que la actividad de superóxido dismutasa y glutatión S-transferasa aumentó significativamente a las 24 h. La peroxidación lipídica aumentó a las 6 h, pero disminuyó a las 48 h. Una potencial consecuencia del estrés oxidativo es el daño a nivel de los tejidos. Para estudiar esta posibilidad sobre el divertículo intestinal, se expusieron adultos a dosis de campo de clorpirifos durante 24 h y se realizaron preparados histológicos teñidos con hematoxilina-eosina. Se observó necrosis desde las 24 h en el divertículo intestinal. Existen otros tipos de insecticidas para los que, a diferencia de los organofosforados, se tiene evidencia de ser relativamente más benignos para los enemigos naturales. Por lo cual, se realizó exposición tópica de 48 h a la dosis de campo de abamectina, una avermectina de uso común como insecticida en agricultura, sobre P. pythagoricus y se cuantificaron las actividades de las enzimas catalasa, como parte del sistema antioxidante y acetilcolinesterasa, como biomarcador de efecto. Además, se cuantificó la peroxidación lipídica para verificar daño oxidativo. No se probaron efectos significativos de la abamectina para ninguna de estas variables. Los plaguicidas son una fuente de estrés de origen antropogénico, pero todo organismo debe enfrentarse también a fluctuaciones de la temperatura ambiental, que son de especial relevancia para los organismos ectotermos como las arañas. Las membranas son estructuras fundamentales de toda célula, cuya función biológica depende de su viscosidad. Este parámetro es afectado por la temperatura y por la composición lipídica. La hipótesis de homeoviscosidad adaptativa propone que, ante aumentos de la temperatura ambiental, la composición lipídica, y principalmente de ácidos grasos de las membranas, se modifica. Además, cambios en los porcentajes de fosfolípidos y colesterol son ajustes frecuentemente observados. Para estudiar como estos mecanismos operan en P. pythagoricus, se aclimataron adultos y juveniles durante 20 días a 1, 4, 10, 25 y 35 °C. Los lípidos totales del divertículo intestinal y el tejido muscular se extrajeron y se caracterizaron por cromatografía en capa fina acoplada a detector de ionización por llama. A partir de los lípidos totales se obtuvieron por saponificación y esterificación los ésteres metílicos de ácidos grasos, cuyos porcentajes se analizaron por cromatografía gaseosa acoplada a detector de ionización por llama. Los resultados indicaron que existieron variaciones lipídicas entre las diferentes temperaturas. Se observaron cambios en colesterol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y triacilgliceroles. Para el caso de los ácidos grasos, a menores temperaturas se observó un aumento de ácidos grasos insaturados (16:1, 18:1) y una disminución concomitante de ácidos grasos saturados (17:0 y 20:0). Múltiples estresores pueden presentarse simultáneamente en el ambiente natural, por lo que entender cómo sus efectos se combinan para impactar sobre los individuos, se vuelve necesario a la hora de evaluar el riesgo sobre los organismos de interés como las arañas. La temperatura como condición ambiental, es por sí misma capaz de provocar estrés oxidativo, lo que podría agravarse si los organismos se exponen además a un segundo factor de estrés, como un insecticida. Para este estudio se aclimataron adultos de P. pythagoricus a 1, 25 y 35 °C durante 20 días, luego se los expuso tópicamente por 24 h a la dosis de campo de clorpirifos y se cuantificaron en divertículo intestinal la actividad de las enzimas del sistema antioxidante y las especies reactivas del oxígeno totales. Como resultado, no se encontró interacción entre las dos fuentes de estrés. Pero si se observó que la temperatura afecta levemente a la catalasa, glutatión-S-transferasa y superóxido dismutasa. 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