Empleo de polielectrolitos inteligentes para desarrollar matrices insolubles con capacidad bioseparativa de enzimas de importancia biotecnológica
Con los avances de la ciencia moderna, principalmente en el campo de la biotecnología, la obtención de enzimas para uso industrial ha creado la necesidad de desarrollar nuevas metodologías para la purificación de las mismas. Los métodos de escalado clásicos para la purificación de enzimas emplean pr...
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Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
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Con los avances de la ciencia moderna, principalmente en el campo de la biotecnología, la obtención de enzimas para uso industrial ha creado la necesidad de desarrollar nuevas metodologías para la purificación de las mismas. Los métodos de escalado clásicos para la purificación de enzimas emplean precipitación con sales o solventes. Dichas técnicas producen gran cantidad de residuos que muchas veces son difíciles de reciclar, incrementando los costos del proceso. Los nuevos protocolos deben reunir una serie de condiciones: ser económicos, con el mínimo de operaciones unitarias y, especialmente, ser amigables con el medio ambiente.
En general, la macromolécula de interés se encuentra diluida en un sistema complejo junto con otras macromoléculas y, en algunos casos, otros componentes celulares. Uno de los principales desafíos del área de la biotecnología denominada bioseparación es encontrar nuevas metodologías con capacidad de separar y purificar la macromolécula de interés del resto de componentes no deseados.
El proceso de bioseparación de proteínas se refiere a la separación y purificación de una proteína a partir de un producto complejo de diversas procedencias como puede ser animal, microbiana, vegetal o artificial. La bioseparación ha adquirido mayor importancia en los últimos años debido a la creciente necesidad de disponer de grandes cantidades de proteínas con diversos grados de pureza, dependiendo del uso final que se le vaya a dar. Esto ha estimulado la búsqueda de fuentes naturales de enzimas junto con el desarrollo de nuevas técnicas bioseparativas y el perfeccionamiento de la obtención de enzimas recombinantes.
Gran parte de los procedimientos tradicionales de purificación de proteínas incluyen varias etapas de precipitación o de adsorción. Para mezclas con baja cantidad de contaminantes y alta concentración de la proteína de interés, la precipitación y la adsorción pueden ser métodos efectivos de concentración y, en algunos casos, pueden actuar como etapa única de purificación, dependiendo del grado de pureza final pretendido.
Una de las técnicas empleadas para la precipitación de enzimas es la formación de complejos insolubles con polielectrolitos. Estos complejos pueden separarse de los contaminantes por una simple decantación y pueden utilizarse para purificar, concentrar y estabilizar a la enzima de interés. Es una técnica simple, rápida, económica y aplicable a gran escala. Una parte de este trabajo de tesis se dedicó a estudiar la formación de complejos insolubles entre la Quimotripsina, una enzima con diversas aplicaciones en la industria, y dos polielectrolitos aniónicos naturales: Carragenano y Alginato. Ambos polímeros son obtenidos de fuentes naturales, por lo que pueden ser descartados en el medio ambiente sin efectos negativos sobre éste. Además, los dos polielectrolitos utilizados son producidos en nuestro país, lo que le otorga más relevancia a los resultados obtenidos: el protocolo de bioseparación puede llevarse a cabo, casi en su totalidad, empleando materiales de fabricación nacional.
La formación de los complejos proteína-polielectrolito se da debido a un conjunto de fuerzas no covalentes que actúan en conjunto. Las principales interacciones son del tipo electrostáticas, aunque pueden participar la formación de puentes hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. La interacción entre ambas macromoléculas será altamente dependiente del pH del medio, la fuerza iónica y del tipo de sales presentes, en el caso de que exista un componente hidrofóbico en la interacción.
El efecto del pH y la fuerza iónica sobre la formación de los complejos fue estudiado mediante el seguimiento de la turbidez del sistema Quimotripsina-polímero en función del pH y la fuerza iónica presente. Utilizando esta técnica pudo concluirse que el sistema Quimotripsina-Carragenano es insoluble a pHs menores a 8,00, alcanzando su máximo de insolubilidad a pHs menores a 5,00. Cuando la titulación se repite en presencia de diferentes concentraciones de NaCl, los pHs de insolubilidad del complejo no cambian significativamente, pero se observa una disminución en la cantidad de complejo insoluble formado, lo que es consistente con un mecanismo culómbico de formación del complejo. Sin embargo, no llega a anularse la interacción, aún ante elevadas concentraciones de sal. El sistema Quimotripsina-Alginato, por su parte, muestra un comportamiento bastante similar: comienza a insolubilizarse a pHs menores a 8,00, alcanzando su máximo a pH 5,00 y comienza a solubilizarse nuevamente a pH menores a 4,90. Este sistema, a diferencia del primero, es altamente sensible a la fuerza iónica del medio: la interacción es completamente anulada en presencia de NaCl 200 mM, evidenciando un mecanismo netamente culómbico de interacción.
Una vez conocidos los pH de solubilidad-insolubilidad de cada caso, se seleccionaron diferentes valores de pH para estudiar la precipitación de la proteína. A estos pHs se realizó la titulación turbidimétrica de una cantidad fija de proteína con cantidades crecientes de cada uno de los polímeros. Los datos obtenidos fueron graficados como turbidez a 420 nm vs [Polímero] obteniéndose curvas sigmoideas y, a partir de dichos gráficos, se obtuvieron las relaciones polímero/proteína para obtener la máxima cantidad de complejo insoluble. En todos los sistemas estudiados se encontró que la cantidad de polímero necesaria para obtener el máximo de enzima precipitada es baja, y se encuentra en el orden de 0,05 mg de polímero/ mg de proteína presente.
Las titulaciones fueron realizadas también en presencia de NaCl y, bajo estas condiciones se encontró, para ambos sistemas, un cambio notable en las relaciones obtenidas, requiriéndose una mayor cantidad de polímero para precipitar una misma cantidad de proteína y alcanzando valores de rendimiento mucho menores. Para el caso del Alginato, la presencia de 200 mM de NaCl anuló la formación de complejo insoluble, corroborando los resultados obtenidos anteriormente. Además, se observó una pérdida del comportamiento sigmoideo de los datos los cuáles mostraron, en este caso, un comportamiento hiperbólico.
Se realizaron también los estudios de cinética de la precipitación, para ello se utilizó una cantidad fija de enzima y de polímero y se midió la turbidez del sistema en función del tiempo. En todos los casos se encontró una cinética de dos pasos: uno que toma entre 0-10 seg y uno lento que necesita de aproximadamente 120 seg. La cinética del proceso se vio claramente afectada por el pH del medio y la presencia de sales en el mismo. Para el sistema Quimotripsina-Carragenano se estudió también el cambio en el tamaño de los agregados formados. Para ello, se realizaron curvas de titulación de una concentración fija de Quimotripsina con Carragenano y se realizó la medición de la absorbancia de la muestra en el rango de 420 a 650 nm. Mediante un adecuado procesamiento de los datos se obtuvo un parámetro denominado el cual es inversamente proporcional al tamaño de los agregados. Se encontró que el tamaño de los mismos aumenta al incrementarse la concentración de polímero en el medio. Esto es consistente con la mayor capacidad para formar agregados insolubles y la capacidad de los mismos de interaccionar entre ellos alcanzando mayor tamaño, al aumentar la concentración de polímero presente.
Los resultados obtenidos mostraron que es factible la utilización de ambos polímeros para precipitar la proteína de interés. Pero, para poder utilizar el protocolo, es necesario comprobar que el polímero no afecte la estructura ni la actividad biológica de la proteína de interés. El efecto de los polímeros sobre la estructura de la Quimotripsina se estudió por diferentes métodos y no se encontraron cambios significativos en la estructura de la enzima cuando la misma se encuentra en presencia de los polielectrolitos. El Carragenano, además, mostró un efecto estabilizante sobre la enzima frente a la desnaturalización térmica y química. En cuanto a la actividad enzimática, se encontró que ninguno de los polielectrolitos utilizados afecta negativamente la actividad catalítica de la Quimotripsina, al menos en las condiciones estudiadas.
Finalmente, los resultados obtenidos fueron tomados como referencia para la precipitación de la proteasa a partir de una fuente natural. En este caso se eligió como fuente de la enzima el páncreas bovino. La aplicación del protocolo de precipitación a un homogenado de páncreas permitió recuperar Quimotripsina a partir de la precipitación utilizando Carragenano con un rendimiento del 60 % y un factor de purificación de 3,0. Cuando el agente precipitante fue Alginato se obtuvo un rendimiento de 36,6 % y un factor de purificación de 3,2. En ambos casos se logró disminuir el volumen inicial 10 veces, lo que conduce a una importante concentración de la muestra de partida.
Por otro lado, la adsorción es una de las operaciones unitarias más utilizadas para la etapa de concentración y purificación de macromoléculas a partir de homogenados de tejidos animales y vegetales, o a partir de caldos de cultivo. En la segunda parte de esta tesis, se estudió la adsorción de Quimotripsina y Tripsina sobre una matriz insoluble de Alginato y Goma Guar entrecruzada covalentemente con epiclorhidrina. Frente al desafío de utilizar las esferas como adsorbentes para la purificación de las enzimas se determinaron, en primer lugar, las mejores condiciones para llevar a cabo la adsorción. Se prepararon para ello, sistemas con una masa fija de matriz y una concentración constante de cada una de las enzimas pero se utilizaron diferentes buffers de adsorción. Los parámetros que se variaron fueron el pH y la fuerza iónica del sistema. Se encontró que la mejor adsorción de Quimotripsina y Tripsina se obtiene trabajando a pH 5,00 en ausencia de sales agregadas. Por ello, se eligió como buffer para realizar la adsorción citrato 25 mM pH 5,00.
La cinética de la adsorción fue llevada a cabo a diferentes temperaturas, pHs y con diferentes concentraciones iníciales de enzima. En todos los casos se encontró que, con el aumento en el tiempo de contacto entre la enzima y la matriz, se produce un incremento en la cantidad de enzima adsorbida hasta que se alcanza un plateau, luego del cual no se producen cambios en la cantidad de proteína unida. Los datos obtenidos fueron ajustados a diferentes modelos cinéticos encontrándose que la adsorción de Quimotripsina puede ser explicada mediante los modelos de pseudo-primer orden y pseudo-segundo orden, mientras que la Tripsina se adsorbe sobre la matriz siguiendo una cinética de pseudo-primer orden. Es importante destacar que el tiempo requerido para alcanzar la máxima adsorción se vio modificado con todas las variables estudiadas, para ambos sistemas.
Las isotermas de adsorción se realizaron a dos temperaturas: 25 ºC y 8 ºC. En ambos casos se trabajó con una agitación de 30 rpm. Los resultados obtenidos fueron ajustados a diferentes modelos de isotermas: Langmuir, Freundlich y Hill. El mejor ajuste de los datos experimentales, con las dos enzimas, se obtuvo con el modelo de isoterma de Hill de 3 parámetros. Dicho modelo de plantea la existencia de un mecanismo de adsorción del tipo cooperativo en el cual la unión de adsorbato en un sitio modifica la afinidad de los sitios libres restantes. Con los parámetros obtenidos en el ajuste de los datos, pudo concluirse que la capacidad de adsorción de la matriz es ligeramente mayor a 8ºC tanto para la Quimotripsina como para la Tripsina. A su vez, se encontró una mayor capacidad de unión de Quimotripsina que de Tripsina a las dos temperaturas estudiadas.
Con datos obtenidos a ambas temperaturas se calcularon, para ambos sistemas, los parámetros termodinámicos del proceso de adsorción. El valor negativo para el cambio de energía libre indica que la adsorción de ambas enzimas en la matriz es un proceso espontáneo. El valor positivo para el cambio de entropía, por otra parte, indica el incremento en el desorden del sistema durante la adsorción. Esto puede deberse a la liberación del agua ordenada alrededor de la matriz y de las enzimas cuando la adsorción tiene lugar.
Una vez determinados los parámetros de la adsorción de ambas enzimas, se comenzó el estudio de la desorción de las mismas. Para ello se eligió variar tres parámetros que afectan notablemente los procesos de adsorción: el pH, la fuerza iónica y la naturaleza del buffer empleado. De las diferentes condiciones ensayadas, el mejor buffer de desorción para la Quimotripsina es el buffer Pi 25 mM pH 7,00 con el agregado de 500 mM de NaCl, con el cual se obtiene un 81 ± 3 % de proteína desorbida. Para la Tripsina, el mayor porcentaje de desorción fue de 76 ± 1 % y se logró con la utilización de buffer Pi 25 mM pH 7,00 con el agregado de 500 mM de NaCl y 20 %P/V de propilenglicol. En los dos sistemas la cinética de desorción es rápida y requiere de menos 10 min para completarse.
Es importante destacar que ninguno de los pasos utilizados en el protocolo de adsorción desarrollado afecta la actividad enzimática de las enzimas en los tiempos determinados para llevar a cabo el protocolo completo.
Los resultados obtenidos se aplicaron a la realización de sucesivos ciclos de adsorción/lavado/desorción utilizando la misma alícuota de matriz. Se encontró que la matriz puede ser reutilizada 5 veces, sin pérdida de su capacidad de adsorción.
Finalmente, se aplicó el protocolo desarrollado a la purificación de ambas enzimas a partir de un homogenado de páncreas bovino. Para la Quimotripsina se obtuvo un factor de purificación de 7 ± 3 y un rendimiento del 44 ± 2 %, mientras que la Tripsina se purificó 5 ± 2 veces con un rendimiento del 17 ± 2 %.
En conclusión, durante este trabajo de Tesis se desarrollaron dos metodologías para la purificación de enzimas basadas en la utilización de polímeros de cadena flexible naturales. Con ambas técnicas se lograron rendimientos y factores de purificación adecuados y, en ninguno de los casos, se vio afectada la estructura ni la actividad de las enzimas en estudio. Es importante resaltar que ambas técnicas son de bajo costo, utilizan materiales biodegradables y, en el caso de la adsorción, la matriz utilizada puede ser reciclada, disminuyendo aún más los costos del proceso. |