Estudio bioquímico y estructural de la metalo-beta-lactamasa NDM-1: residuos de segunda esfera e implicancias de su anclaje a membrana

La resistencia bacteriana a antibióticos representa hoy una de las amenazas más serias a la salud. Las infecciones causadas por bacterias resistentes son cada vez más comunes en los ambientes clínicos, y algunos patógenos se han vuelto resistentes a varias clases de antibióticos, limitando las posib...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Giannini, Estefanía
Otros Autores: Vila, Alejandro J.
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: 2021
Materias:
Resistencia a antibióticos
Metalo-beta-lactamasa NDM-1
beta-Lactamas
Bacterias Gramnegativas
Carbapenémicos
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/21483
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description La resistencia bacteriana a antibióticos representa hoy una de las amenazas más serias a la salud. Las infecciones causadas por bacterias resistentes son cada vez más comunes en los ambientes clínicos, y algunos patógenos se han vuelto resistentes a varias clases de antibióticos, limitando las posibilidades de tratamiento. En particular, la diseminación mundial de bacterias Gram-negativas resistentes a carbapenemes se ha vuelto una causa importante de morbilidad y mortalidad. Las carbapenemasas son β-lactamasas capaces de hidrolizar los carbapenemes (antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso terapéutico para el tratamiento de infecciones resistentes a la mayoría de los fármacos). Las carbapenemasas de mayor diseminación clínica son las metalo-β-lactamasas (MBLs), enzimas con una gran versatilidad, ya que son capaces de inactivar igualmente bien las penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. En la actualidad, no existen inhibidores de MBLs de uso clínico. La carbapenemasa NDM-1, se ha expandido a más de 80 países en solamente 12 años y su gen se encuentra acoplado a un cassette de multi-resistencia. Más aún, el gen de NDM-1 ha sido encontrado en gran cantidad de bacterias ambientales en la comunidad, por lo cual su riesgo de diseminación es aún mayor. La enzima NDM-1 posee un sitio activo conservado en todas las MBLs de impacto clínico (como las enzimas del tipo VIM, IMP y SPM). Estas poseen dos sitios de unión a metal, el llamado sitio Zn1, compuesto por los residuos His116, His118 e His196, y el sitio Zn2, formado por los residuos Asp120, Cys221 e His263. Ambos iones Zn(II) son esenciales y están implicados en el mecanismo de hidrólisis de los antibióticos β-lactámicos. Asimismo, las MBLs poseen un conjunto de residuos de segunda esfera de coordinación (RSCs) que forman una red de enlaces de hidrógeno conservada por debajo de la base del sitio activo. Esta red involucra residuos de distintas regiones de la cadena polipeptídica y uno o más de los ligandos metálicos. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, la cual es reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Se encuentra ampliamente reportado que el ambiente biológico influye en el plegamiento, la estabilidad y la función proteica. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, revelaron que las determinaciones de actividad de MBLs solubles en extractos periplasmáticos reflejan mucho mejor las influencias del entorno nativo de estas enzimas respecto a las determinaciones in vitro con proteínas recombinantes. En el caso particular de las proteínas que se encuentran en el entorno de las membranas biológicas, hay cada vez más evidencia del rol activo de los lípidos en la modulación de su actividad. Por este motivo, en este trabajo de Tesis, nos propusimos desarrollar un sistema modelo para caracterizar NDM-1 simulando su entorno nativo de membrana. La evaluación de actividad β-lactamasa de NDM-1 en preparaciones de membranas totales, micelas de Tritón X-100 y esferoplastos de E. coli, reveló que la enzima se encontraba activa en los tres sistemas. La comparación de NDM-1 en su forma lipidada en esferoplastos y soluble en periplasma, mostró un incremento de eficiencia catalítica para la variante soluble NDM-1-C26A, principalmente influenciado por el valor de KM. Esta diferencia nos permitió hipotetizar que el sitio activo de la variante soluble podría estar más accesible al medio, mientras que en el caso de NDM-1 lipidada su cercanía a la membrana podría estar afectando la unión del sustrato. Por otro lado, ensayos de estabilidad cinética de NDM-1 luego del agregado de Proteinasa K, revelaron que el anclaje no altera la estabilidad de NDM-1 respecto a la de su variante soluble. Continuando con la caracterización de NDM-1 en su forma lipidada, se logró sobreexpresar y purificar la enzima en complejo con detergentes. Se realizaron pruebas de cristalogénesis y fue posible obtener cristales del complejo NDM-1-DDM. Si bien la resolución no fue suficientemente para resolver la estructura e inferir sobre la posible orientación de NDM-1 respecto a la membrana, resulta interesante continuar trabajando en la optimización de los mismos. Por último, se estudió el impacto de mutaciones en RSCs en NDM-1. Estos RSCs modulan fuertemente la estructura y función de las enzimas, siendo capaces de modular tanto la afinidad por Zn(II) como la especificidad de sustrato de las MBLs de impacto clínico. Resulta interesante comprender estos fenómenos y el impacto de mutaciones en RSCs en la evolución de MBLs hacia enzimas optimizadas. Hasta el momento se han reportado 27 variantes alélicas de NDM-1, las cuales son poco divergentes y ninguna posee mutaciones en RSCs. Se aleatorizaron los codones en tres posiciones correspondientes a RSCs (D84, K121 y S262) y se seleccionaron mutantes funcionales. En general la capacidad de las mutantes de conferir resistencia frente a los antibióticos β-lactámicos ensayados fue menor que la de NDM-1, sin embargo, mostraron eficiencias catalíticas dentro del mismo orden. Por otro lado, se evaluó la estabilidad de estas mutantes en condiciones de limitación de metal. Resultó interesante el incremento de estabilidad observado para el apo-derivado (enzima inactiva sin metal) de la mutante K121S. Este incremento resulta relevante en los sitios de infección, donde el hospedador libera al medio grandes cantidades de proteínas quelantes de metal que reducen la disponibilidad del cofactor Zn(II), esencial para la actividad de las MBL. Esta mutación podría resultar, en combinación con otras, relevante en la evolución de NDM-1, fijando nuevos caminos evolutivos de esta enzima de reciente aparición.

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