Producción de células fúngicas y su aislamiento utilizando polielectrolitos
La enzima celulasa tiene una vasta aplicación industrial para la producción de biocombustibles, en la industria del papel, del detergente y textil. Los tres componentes que conforman el complejo enzimático (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa) pueden efectivamente degradar la celulosa. La...
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| Publicado: |
Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
2019
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La enzima celulasa tiene una vasta aplicación industrial para la producción de
biocombustibles, en la industria del papel, del detergente y textil. Los tres componentes
que conforman el complejo enzimático (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa)
pueden efectivamente degradar la celulosa. La fermentación en estado sólido (FES)
llevada a cabo por hongos es una ruta de producción interesante debido a su bajo costo
entre otras ventajas. En este trabajo se realizó la producción de celulasa por Aspergillus
niger y Trichoderma harzianum por fermentación en estado sólido utilizando papel de
desecho, marlo de maíz, cáscaras de soja, pellet de cáscaras de soja y residuos de la
cosecha de soja, como soportes, y medio Mandels, en una proporción adecuada para
alcanzar el porcentaje de humedad óptimo del sistema. El efecto del soporte sobre la
producción de celulasa fue ensayado bajo un diseño factorial completamente
aleatorizado. La interacción de los factores soporte-tiempo fue significativa para todas
las variables estudiadas. Los soportes fueron caracterizados en términos de absorción de
agua y punto de humedad crítico. Las muestras de cultivo fueron analizadas con
Microscopía Electrónica de Barrido para visualizar la presencia de esporas y el
crecimiento fúngico.
La máxima actividad endoglucanasa fue encontrada a las 96 h utilizando cáscaras de
soja como soporte (5914 U L-1). La actividad exoglucanasa fue máxima a las 96 h
(4551 U L-1), siendo nueve veces mayor que la obtenida en papel residual al mismo
tiempo de fermentación. La máxima actividad β-glucosidasa fue obtenida en cáscaras de
soja alcanzándose un valor de 984 U L-1 a las 96 h. Además el uso de cáscaras de soja
produjo altas productividades volumétricas a cortos tiempos de fermentación, y este
hecho disminuye los costos de producción considerando un escalado del proceso.
La velocidad de crecimiento radial (Vr) se evalúo en tres cepas de hongos: Trichoderma
harzianum T104, Aspergillus niger GH1, Aspergillus niger NRRL3. Debido a que los
datos de crecimiento radial han sido recolectados a través del tiempo, se llevó adelante
un análisis estadístico longitudinal a través de un modelo mixto de medidas repetidas,
mediante el software estadístico R. Según el análisis de la estructura de correlación de
las medidas de crecimiento de las cepas en el tiempo, se determinó que la mejor
alternativa para modelar los datos es la estructura autorregresiva.
El modelo de medidas repetidas considerado, reveló que existe relación entre el tipo de
cepa y el tiempo de crecimiento (p<0,0001) para al menos una de las cepas. Evaluando
luego los contrastes de a pares de los medidas de crecimiento para cada cepa, se
encontró que no existen diferencias estadísticamente significativas en cuanto al
crecimiento en el tiempo de las cepas A. niger NRRL3 y A. niger GH1. A. niger GH1 y
A. niger NRRL3 presentaron valores de Vr superiores a T. harzianum T104, siendo
cuatro y cinco veces mayor respectivamente.
Se evaluó el efecto del tiempo en la producción de celulasa para el soporte cáscaras de
soja bajo un diseño completamente aleatorizado mediante un ANOVA unifactorial para
cada una de las variables estudiadas (biomasa, actividad enzimática, proteínas totales,
actividad específica, productividad volumétrica, productividad específica). Se
observaron diferencias estadísticamente significativas para todas las variables
estudiadas en los distintos tiempos ensayados.
Las imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido exhibieron una superficie rugosa
de las cáscaras de soja. Se visualizó crecimiento fúngico sobre el soporte. Pudieron
observarse hifas, esporas y conidióforos. Las esporas presentaron un rango de 2-3 μm
de diámetro.
En el presente trabajo se determinaron la temperatura óptima de actividad
endoglucanasa y condiciones de estabilidad frente a pH y temperatura de un liofilizado
comercial de la enzima. La temperatura óptima de la enzima endoglucanasa fue de 50°C
y se observó que la endoglucanasa presentó un rango de temperatura de estabilidad
entre 30ºC y 50ºC. Luego de 2 h de incubación la enzima disminuyó su actividad a un
pH de 3,00. Por otra parte, se estudió la estructura secundaria de la engoglucanasa de
Megazyme (EG) a diferentes valores de pH. Se observó una mayor disminución del
contenido de estructura secundaria a pH 5,30 y 6,00 respecto de los otros pH estudiados.
Además, se estudió la extinción de la fluorescencia de endoglucanasa nativa (EG) a
diferentes valores de pH utilizando acrilamida como quencher. A pH 3,00 disminuyó la
accesibilidad o afinidad del quencher por la enzima, disminuyendo su capacidad de
interaccionar con dominios proteicos de la misma.
En el presente trabajo se abordó el desarrollo de un método de aislamiento y
purificación de la enzima producida por Aspergillus niger utilizando polímeros de
cadena flexible: uno de ellos, sintético y aniónico, polivinil sulfonato de sodio (PVS); el
otro natural y catiónico, chitosan (CHS).
Además se estudiaron las mejores condiciones en las cuales ciertos polímeros de cadena
flexible producen complejos insolubles con proteínas a través de mediciones de turbidez
del medio (absorbancia a 420 nm).
Se analizaron los efectos de la concentración de polímero, concentración de enzima, pH
y fuerza iónica del medio, sobre la formación del complejo polímero-endoglucanasa. Se
encontraron las relaciones óptimas de masas polímero/endoglucanasa comercial del
complejo, y su rango de solubilidad. Se analizó, además, la forma de redisolución del
mismo y la posibilidad de solubilizar a la proteína aislada de las impurezas presentes en
su fuente natural.
Luego de aplicado el método de precipitación se evaluó el estado funcional de la
proteína en el precipitado y en el sobrenadante a través de medidas de actividad
enzimática. También se analizaron el rendimiento y el factor de purificación.
Los resultados obtenidos permitieron diseñar un método de aislamiento y purificación
de celulasa utilizando precipitación por formación de complejos insolubles sobre un
extracto enzimático obtenido a partir del cultivo de A. niger en medio sólido, utilizando
como fuente de carbono y como soporte de crecimiento desechos agroindustriales.
Se sintetizaron diferentes matrices poliméricas esféricas: esferas de CHS 2,5% P/V en
HAc 5% V/V, matriz triturada de CHS 3% P/V en HAc 1% V/V, esferas de CHS
entrecruzadas con epiclorhidrina,, esferas de CHS 2% P/V en HAc 5% V/V, CHS 2%
P/V entrecruzada con Glutaraldehído 0,5% P/V, esferas de CHS - Eudragit® EPO,
esferas de Alginato – Goma Arábiga.
Se realizó la caracterización de las mismas mediante microscopía electrónica de barrido,
espectrometría infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) utilizando Reflectancia
Total Atenuada (ATR) de las matrices y titulación potenciométrica. Se realizaron
estudios cinética de adsorción sobre las matrices obtenidas. Se llevó a cabo un estudio
de adsorción endoglucanasa de origen fúngico sobre diferentes matrices para evaluar las
variables factor de purificación y rendimiento. Según los resultados obtenidos,
utilizando la matriz esférica de CHS 2% P/V entrecruzada con Glutaraldehído 0,5% P/V
produjo los mayores valores de purificación y rendimiento para la adsorción de
endoglucanasa de un cultivo fúngico.
Se realizó un análisis ANOVA Bifactorial (matriz, tiempo) para la variable purificación
y rendimiento del proceso de adsorción de la enzima endoglucanasa de origen fúngico
con las matrices utilizadas. La interacción matriz-tiempo resultó significativa (p<0,001).
Se obtuvieron membranas de chitosán. Las mismas fueron funcionalizadas con
aminoácidos y cobre para mejorar la selectividad de adsorción de endoglucanasa. Las
membranas fueron caracterizadas a través de espectroscopía infrarroja con transformada
de Fourier con reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) para monitorear los cambios
químicos. Microscopía electrónica de barrido (SEM) fue realizada para comparar la
morfología de la superficie de las membranas obtenidas. Análisis termogravimétrico
(TGA) y calorimetría diferencial de barrido fueron realizadas para analizar la
estabilidad termal e identificar las diferencias entre las membranas funcionalizadas
antes y después de la adsorción. Los resultados de SEM evidenciaron que la
funcionalización se produjo dado que la superficie de la membrana de chitosán presentó
modificaciones. Los resultados de FTIR-ATR confirmaron una efectiva modificación
química de las membranas de chitosán con aminoácidos y cobre y además corroboraron
también la adsorción de endoglucanasa. Los parámetros característicos de DSC y TGA
evidenciaron la adsorción de la enzima sobre las membranas. La utilización de las
membranas funcionalizadas como adsorbentes produjo un incremento en el porcentaje
de adsorción endoglucanasa en relación a la membrana de chitosán sin modificar. De
acuerdo a estos resultados, las membranas de chitosán funcionalizadas con aminoácidos
y cobre podrían representar un novedoso adsorbente de bajo costo para potenciales
aplicaciones para purificación de endoglucanasa de sistemas complejos. |