Transporte de hemo y biosíntesis de hemo A en Trypanosoma cruzi

El hemo es una molécula esencial para la mayoría de los organismos aeróbicos (Koreny et al., 2013). Su biosíntesis consta de 8 pasos enzimáticos y está conservada a los largo de la evolución (Korený et al., 2010; Panek y O'Brian, 2002). Trypanosoma cruzi, el protista causante de la enfermedad d...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Merli, Marcelo Luciano
Otros Autores: Cricco, Julia Alejandra
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. 2019
Materias:
Hemo
Hemo A
Trypanosoma cruzi
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/15640
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description El hemo es una molécula esencial para la mayoría de los organismos aeróbicos (Koreny et al., 2013). Su biosíntesis consta de 8 pasos enzimáticos y está conservada a los largo de la evolución (Korený et al., 2010; Panek y O'Brian, 2002). Trypanosoma cruzi, el protista causante de la enfermedad de Chagas-Mazza, no es capaz de sintetizar el hemo por lo que debe incorporarlo ya sea del hospedador mamífero o del insecto vector y al mismo tiempo controlar los niveles intracelulares para evitar su toxicidad (Korený et al., 2010). El hemo no puede atravesar libremente las membranas biológicas, por ello está aceptado que existen transportadores proteicos dedicados a esta función (Cupello et al., 2011; Lara et al., 2007) y de esta manera pueda ser distribuido entre los diferentes compartimentos subcelulares incluida la mitocondria. En ella se incorpora a diferentes hemoproteínas, siendo una de las más relevantes la citocromo c oxidasa (CcO) del tipo aa3 de la cadena transportadora de electrones (complejo IV) (Tripodi et al., 2011). En este trabajo de tesis nos proponemos entonces estudiar aspectos generales del transporte y del metabolismo de hemo en epimastigotes de T. cruzi: requerimiento del hemo en el crecimiento, efecto tóxico y posibles vías de degradación, y mediante el uso de distintos análogos fluorescentes de hemo (AHs) avanzar en la caracterización del transporte de hemo. Los AHs poseen estructuras similares al hemo pero sus propiedades fluorescentes permiten el estudio del transporte mediante técnicas espectroscópicas y de microscopía de fluorescencia. Por otro lado, se estudió el rol de TcCox15, la enzima hemo A sintasa (HAS) de T. cruzi responsable de la segunda reacción de la conversión del hemo en hemo A: cofactor únicamente de la CcO del tipo aa3. Para ello se obtuvieron anticuerpos específicos contra la proteína que permitieron estudiar los niveles de TcCox15 en los distintos estadios y su localización, y se generaron mutantes puntuales de TcCox15 cuya expresión en los distintos estadios del parásito permitieron evaluar el rol de esta enzima. Nuestros resultados nos permiten proponer que los epimastigotes de T. cruzi captan más hemo del mínimo necesario para cumplir con sus funciones celulares y pueden almacenarlo para usos posteriores aunque estas reservas son limitadas; tienen capacidad de regular la cantidad de hemo intracelular y ante una disminución de este, incrementan su capacidad de tomarlo del medio adaptándose a variaciones en la disponibilidad del hemo del entorno. Por otro lado se corroboró que no tienen actividad ferroquelatasa (FeCH), la última enzima de la vía de síntesis de hemo. Todos los AHs ensayados interfirieron con el transporte de hemo por parte del parásito, aunque solo algunos fueron transportados y solo los que fueron incorporados lograron ejercer un efecto tóxico. Esta selectividad en el transporte no fue igual en todas las cepas estudiadas, lo que apoyaría la hipótesis de un sistema de transporte de hemo específico mediado por un complejo proteico especializado. Con respecto a la síntesis de hemo A, se identificaron en el genoma de T. cruzi por búsqueda bioinformática genes que podrían participar junto a TcCox15 en la síntesis de hemo A y en el ensamblado del CcO: una posible ferredoxina Yah1, una posible ferredoxina reductasa Arh1 y una secuencia con homología a Shy1. La presencia de estas proteínas (probables) apoyarían la hipótesis de que la síntesis de hemo A en T. cruzi, la reacción catalizada por la enzima HAS, procedería de manera similar a lo que sucede en otros organismos eucariotas como S. cerevisiae y justifica la actividad observada por TcCox15 cuando se expresó en células de levaduras cox15Δ (Buchensky et al., 2010 y este trabajo de tesis). En cuanto a TcCox15, se determinó que su localización es mitocondrial como en las demás eucariotas y sus niveles de acumulación fueron mayores en los estadios replicativos, epimastigote y amastigote (aunque es mayor en epimastigote), en comparación con el estadio infectivo de tripomastigote. En ensayos de complementación en levadura cox15Δ se determinó que la fusión de GFP al C-terminal de TcCox15 afecta la función de la enzima y que incluso se afectaría el funcionamiento de la Cox15 endógena de levaduras cuando TcCox15.His.GFP se expresó en un entorno salvaje. Por último, los residuos H129, H206 y H307 de TcCox15 conservados en la familia de enzimas con actividad HAS, resultaron esenciales para la actividad de esta enzima. El reemplazo de los residuos de histidinas por alaninas generó mutantes no funcionales y el análisis de la sobreexpresión de estas mutantes en los distintos estadios nos permitieron determinar que la síntesis de hemo A es esencial para el crecimiento de los epimastigotes y para la actividad de la CcO, demostrando además que esta sería la oxidasa terminal principal del parásito. Además afectar la ruta de síntesis de hemo A causó un efecto negativo sobre la infección de tripomastigotes (en las primeras etapas de la infección) y sobre la replicación intracelular de amastigotes.

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