Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis

. subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que...

Descripción completa

Guardado en:
Detalles Bibliográficos
Autor principal: Saita, Emilio Adolfo
Otros Autores: De Mendoza, Diego
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. 2018
Materias:
Histidina Quinasa
Termosensor
Membranas
DesK
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/13412
http://hdl.handle.net/2133/13412
Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
id I15-R121-2133-13412
record_format dspace
institution Universidad Nacional de Rosario
institution_str I-15
repository_str R-121
collection Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR)
language Español
orig_language_str_mv spa
topic Histidina Quinasa
Termosensor
Membranas
DesK
spellingShingle Histidina Quinasa
Termosensor
Membranas
DesK
Saita, Emilio Adolfo
Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
topic_facet Histidina Quinasa
Termosensor
Membranas
DesK
author2 De Mendoza, Diego
author_facet De Mendoza, Diego
Saita, Emilio Adolfo
format doctoralThesis
Tésis de Doctorado
acceptedVersion
author Saita, Emilio Adolfo
author_sort Saita, Emilio Adolfo
title Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
title_short Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
title_full Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
title_fullStr Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
title_full_unstemmed Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis
title_sort caracterización estructural y funcional del termosensor desk de bacillus subtilis
publisher Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas.
publishDate 2018
url http://hdl.handle.net/2133/13412
http://hdl.handle.net/2133/13412
work_keys_str_mv AT saitaemilioadolfo caracterizacionestructuralyfuncionaldeltermosensordeskdebacillussubtilis
bdutipo_str Repositorios
_version_ 1764820408223137792
description . subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que codifica para una Δ5 acil lípido desaturasa, la cual genera insaturaciones en los ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana plasmática modificando la fluidez de la misma. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar los eventos moleculares que tienen lugar en los segmentos transmembrana (TM) de DesK durante la detección de la señal de temperatura. La estrategia inicial que decidimos aplicar es la marcación de spin sitio-dirigida y posterior medición por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Dicha estrategia implica la unión de una sonda de spin a residuos de cisteína ubicados en diferentes posiciones de los segmentos TM, para estudiar la dinámica de los mismos en membranas artificiales. Este procedimiento requiere de la purificación de las proteínas en estudio a homogeneidad. Hasta la escritura de esta tesis, los estudios in vitro de DesK completa requerían de la utilización de un sistema de expresión in vitro. Aunque el sistema libre de células ha demostrado ser adecuado para la expresión de DesK, el mismo es muy costosos para ser usado de forma rutinaria. Por este motivo, en una primera instancia nos enfocamos en desarrollar un protocolo que permitiese purificar DesK a partir de cultivos bacterianos, en concentración y pureza suficientes para estudios biofísicos posteriores a un costo reducido. Con este fin, ensayamos diversas estrategias para la expresión y purificación de DesK, incluyendo diferentes vectores de expresión, medios de cultivo, condiciones de crecimiento para la expresión proteica, detergentes para la solubilización de las proteínas de membrana y diversas técnicas cromatográfícas. En función de los resultados obtenidos planificamos un protocolo que permitirán purificar DesK a homogeneidad en micelas de detergente. Resultados posteriores mostraron que la integración de DesK en liposomas permite incrementar la pureza de la misma, indicando que sería posible realizar la marcación con la sonda de spin de las proteínas purificadas en detergente, y posteriormente reconstituir las mismas en liposomas para las subsiguientes mediciones por EPR. Por otra parte, a partir de un análisis informático de covariancia de residuos identificamos pares de aminoácidos con alta probabilidad de interaccionar, ya sea por su cercanía en la estructura cuaternaria, o a través del esqueleto peptídico de DesK. En función a estos resultados seleccionamos posiciones de los segmentos TM que próximamente se reemplazarán por cisteínas, generando variantes de DesK con mutaciones puntuales, para su posterior marcación con la sonda de spin y mediciones de EPR. Estos experimentos ermitirían obtener información estructural y dinámica de los segmentos TM durante la detección de la señal de temperatura. En base a predicciones de estructura secundaria junto con el análisis de las estructuras cristalográficas de la porción catalítica soluble de DesK (DesKC) en distintos estados funcionales, identificamos un motivo de hélices enrolladas (2-HCC) que conecta el dominio TM sensor y el dominio catalítico soluble. La construcción de dos variantes de DesK en las cuales se estabilizó (DesKSTA) o desestabilizó (DesKDEST) el dominio 2-HCC mediante mutaciones puntuales permitió determinar que este motivo juega un rol importante en la regulación de las actividades catalíticas de DesK. Además, de acuerdo con medidas de actividad in vitro de DesK salvaje y DesKSTA insertadas en liposomas, y a ensayos de dinámica molecular de modelos atómicos de DesK salvaje, DesKDEST y DesKSTA, se propuso que en el estado fosfatasa las hélices del segmento TM5 podrían continuar formando un 2-HCC a través de toda la membrana, y que la hidratación de este motivo podría favorecer la apertura del mismo durante la transición al estado auto-quinasa. Por otra parte, se construyeron modelos del estado fosfatasa y auto-quinasa de una quimera funcional de DesK (MS-DesK), la cual posee un único segmento TM por monómero, generado por la fusión de los 17 residuos N-terminales de DesK a los 14 residuos C-terminales del TM5 de DesK. En función a ensayos de dinámica molecular de estos modelos embebidos en bicapas lipídicas de diferente espesor, se propuso un modelo para la detección y transmisión de la señal de temperatura por parte de MS-DesK. En este modelo, a 37 ºC la membrana se encuentra fluida y delgada, y MS-DesK adopta una conformación fosfatasa competente, caracterizada por el enrollamiento de las hélices TM formando un 2-HCC que se prolonga hacia el dominio citoplasmático. Los residuos polares del extremo N-terminal de los segmentos TM se encuentran hidratados debido a la apertura del 2-HCC generada por la bisagra formada entre Gly13 y Pro16, y los dominios de unión a ATP (ABDs) interaccionan fuertemente con el dominio de dimerización y fosforilación de histidina (DHp). Frente a una disminución de la temperatura, la membrana pierde fluidez y se ensancha, generando un movimiento de tijera en el N-terminal de los segmentos TM, favoreciendo la deshidratación de los residuos polares. Los segmentos TM sufren un estiramiento debido al cierre del extremo N-terminal y al segmento citoplasmático KERER que permanece anclado en la interface lípido-agua citoplasmática. Este estiramiento promueve la rotación de las hélices que a su vez provoca el desenrollamiento de los segmentos TM y del 2-HCC. El desenrollamiento estaría favorecido por la hidratación de los residuos polares que se orientan hacia el núcleo del CC. Esta rotación se transmite al DHp, que ahora esconde los residuos hidrofóbicos que le permitían interaccionar con los ABDs. Finalmente, los ABDs quedan libres favoreciendo el estado auto-quinasa competente.

Ejemplares similares