Estudios de inhibición y flexibilidad en enzimas metalo-β-lactamasas

La resistencia bacteriana a los antibióticos -lactámicos constituye uno de los problemas clínicos más preocupantes en la actualidad y ha sido reconocida por la comunidad científica la urgente necesidad de llevar a cabo programas para la identificación de nuevos compuestos antibacterianos que puedan...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: González, Mariano Martín
Otros Autores: Vila, Alejandro J.
Formato: doctoralThesis Tésis de Doctorado acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas 2018
Materias:
Metaloenzimas
Inhibición
Flexibilidad
Acceso en línea:http://hdl.handle.net/2133/11038
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Aporte de:
Repositorio Hipermedial de la Universidad Nacional de Rosario (UNR) de Universidad Nacional de Rosario
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description La resistencia bacteriana a los antibióticos -lactámicos constituye uno de los problemas clínicos más preocupantes en la actualidad y ha sido reconocida por la comunidad científica la urgente necesidad de llevar a cabo programas para la identificación de nuevos compuestos antibacterianos que puedan paliar esta situación. Uno de los mecanismos de resistencia más importantes constituye la expresión de enzimas capaces de inactivar a los -lactámicos denominadas -lactamasas. Las enzimas serín--lactamasas (SBLs), las cuales presentan una Ser esencial en el sitio activo, fueron las primeras enzimas identificadas capaces de inactivar a estos antibióticos. Las -lactamasas dependientes de Zn(II), denominadas metalo--lactamasas (MBLs), fueron identificadas inicialmente en cepas inocuas. Sin embargo, a partir de finales de la década de 1980, nuevas y más eficientes MBLs fueron identificadas en diversas cepas de Enterobacterias y patógenos oportunistas, lo cual promovió el estudio e identificación de los rasgos moleculares y biofísicos que participan durante el mecanismo catalítico y evolución en estas enzimas. El estudio del mecanismo catalítico en las enzimas SBLs permitió el diseño de inhibidores basados en el mecanismo. Hoy en día estos inhibidores se administran junto con los -lactámicos para el tratamiento de infecciones. Sin embargo, debido a que el mecanismo catalítico en las MBLs es fundamentalmente distinto, no ha sido posible identificar inhibidores en base al mecanismo y no hay inhibidores de uso clínico disponibles. Durante el presente trabajo de Tesis se diseñaron y sintetizaron 4 bistiazolidinas que presentan dos anillos de tiazolidina fusionados por un átomo de nitrógeno, un grupo carboxilato similar al carboxilato presente en las posiciones 3 de penicilinas y carbapenemes y en posición 4 de cefalosporinas junto con un grupo tiol que provee un motivo de unión a metal. Estos compuestos constituyen 2 pares de enantiómeros que difieren en la presencia de un grupo gemdimetilo similar al encontrado en las penicilinas. Los mismos fueron ensayados como inhibidores de MBLs de distintas subclases: NDM-1, IMP-1 y BcII (B1), Sfh-I (B2), L1 y GOB-18 (B3). Por otro lado, las MBLs constituyen un sistema modelo ideal para el estudio de la evolución de proteínas, ya que es posible desarrollar un sistema que permita la evolución dirigida de estas enzimas en el laboratorio. Previamente, se había obtenido por estas técnicas una variante evolucionada de BcII que confería mayor resistencia a la bacteria hospedadora contra un antibiótico pobremente hidrolizado por la enzima silvestre. En este trabajo de Tesis exploramos la hipótesis acerca de si la dinámica conformacional en proteínas puede constituir un rasgo evolutivo susceptible de ser optimizado para conferir una mayor capacidad de adaptación a un nuevo desafío funcional. Como conclusiones generales podemos mencionar: 1) Las bistiazolidinas ideadas y sintetizadas para ser ensayadas como inhibidores de MBLs, fueron capaces de inhibir la actividad carbapenemasa de NDM-1, una enzima que se ha diseminado muy rápidamente entre diferentes cepas patógenas en todo el mundo. 2) Asimismo, estos compuestos demostraron ser capaces incluso de inhibir la actividad de enzimas de subclase B1, B2 y B3. Estos resultados indican que las bistiazolidinas son capaces de unirse eficientemente y ejercer un efecto inhibitorio en enzimas con diferentes topologías en los sitios activos. 3) Con excepción del caso de los derivados de la serie L- con Sfh-I, no se observó una clara diferencia en la potencia inhibitoria debida a la estereoquímica de los compuestos ni en la presencia o ausencia del grupo gemdimetilo. Para el caso de Sfh-I se observó una clara preferencia por los derivados de la serie L-, los cuales mostraron una disminución de dos órdenes de magnitud en cuanto a los valores de Ki. 4) Mediante experimentos de RMN demostramos que estos compuestos son capaces de penetrar al interior de la bacteria atravesando la membrana externa de E. coli e inhibir a la enzima in situ. Asimismo, los experimentos de muerte celular llevados a cabo en bacterias que expresan MBLs dan cuenta de la capacidad de estas bistiazolidinas de restaurar la susceptibilidad hacia los -lactámicos. 5) A partir de las estructuras cristalográficas podemos observar que las bistiazolidinas presentan la capacidad de unirse a los sitios activos de las MBLs en diferentes conformaciones. En general, salvo para el caso de L-CS319 con Sfh-I, las bistiazolidinas se unen al sitio activo mediante coordinación del grupo tiol entre ambos iones Zn(II) a distancias similares para Zn1 y Zn2, desplazando a la molécula de agua/hidróxido a puente. El carboxilato de estos compuestos queda interactuando con residuos estructuralmente equivalentes en enzimas de subclase B1 y B3 (Lys224 y Ser223, respectivamente). Para el caso de los derivados de la serie D-, la unión de los compuestos es ligeramente diferente, presentando una interacción entre el N de fusión de anillos con el Zn2, similar a lo observado en las estructuras cristalográficas de aductos enzima:-lactámico. 6) En el caso de L-CS319 unido a Sfh-I se observó que este compuesto se une por medio del carboxilato al sitio metálico, mientras que el grupo tiol se posiciona dentro de la región hidrofóbica 3. Esto contrasta con la estructura reportada entre la enzima B2 CphA y D-captopril, en donde si bien en este caso también el compuesto se une por medio del carboxilato al metal, el tiol queda en una posición más expuesta sobre la superficie del sitio activo. Es posible que la diferencia de potencia inhibitoria de los derivados de la serie L- se deba a que solo estos compuestos presentarían la capacidad de unirse de esta forma a Sfh-I. Dado que las enzimas de subclase B2 son carbapenemasas exclusivas, la topología de los sitios activos de estas enzimas serían capaces de ejercer una mayor restricción en cuanto a qué compuestos pueden ingresar y unirse en los mismos. 7) Por último estudiamos cómo es modulada la flexibilidad conformacional en las MBLs durante la evolución. El estudio por RMN de las variantes BcII wt, BcII G262, BcII N70S y BcII G262/N70S nos permitió establecer que (1) el análisis de las señales en los espectros 1H-15N HSQC indican perturbaciones precisas en la estructura y dinámica proteica que dan cuenta del efecto de las mutaciones en la afinidad por Zn(II); (2) el impacto de las mutaciones en la dinámica depende fuertemente del contexto genético, es decir, es epistático; y (3) la vía exitosa acumula mutaciones sucesivamente incrementando la dinámica de los bucles del sitio activo principalmente en la escala de micro a milisegundos, dando origen a un perfil de sustrato más amplio. Estos resultados nos permiten sugerir que la dinámica conformacional en escalas de tiempo catalíticamente relevantes es un importante rasgo biofísico en la evolución de proteínas.

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