Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1

La evaluación de la interacción directa entre patógenos y receptores inmunitarios suele implicar técnicas sofisticadas o el uso de cepas transgénicas y células modificadas genéticamente. En este trabajo, se describe un método alternativo para detectar la interacción bioquímica entre el sensor microb...

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Detalles Bibliográficos
Autores principales: Barbero, Angela María, Hernández Del Pino, Rodrigo Emanuel, García, Verónica Edith, Pasquinelli, Virginia
Otros Autores: https://orcid.org/0000-0002-7687-0219
Formato: Artículo publishedVersion
Lenguaje:Inglés
Publicado: Journal of Visualized Experiments 2025
Materias:
M. tuberculosis
SLAMF1
Interacción
Acceso en línea:http://repositorio.unnoba.edu.ar/xmlui/handle/23601/927
Aporte de:
Re DI Repositorio Digital UNNOBA de Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires
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description La evaluación de la interacción directa entre patógenos y receptores inmunitarios suele implicar técnicas sofisticadas o el uso de cepas transgénicas y células modificadas genéticamente. En este trabajo, se describe un método alternativo para detectar la interacción bioquímica entre el sensor microbiano de macrófagos SLAMF1 y Mycobacterium tuberculosis. Se desarrollaron dos enfoques técnicos que emplean citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Se generaron extractos de proteínas celulares totales de macrófagos humanos, que luego se incubaron con células completas de M. tuberculosis (WCMtb) o antígenos de M. tuberculosis (Ag Mtb) durante la noche a 4 °C y finalmente se entrecruzaron mediante un tratamiento con formaldehído/glicina/etilenglicol bis (succinimidil succinato). La interacción de SLAMF1 con WCMtb mediante citometría de flujo se detectó con un anticuerpo anti-SLAMF1 PE. La existencia de interacción mediante microscopía de fluorescencia se determinó mediante la fijación de Ags de Mtb teñidos con rodamina-PE a cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, que se incubaron con el extracto proteico total de macrófagos derivados de monocitos. Tras el tratamiento de entrecruzamiento, se visualizó SLAMF1 mediante anticuerpos primarios (anti-SLAMF1) y secundarios (Alexa Fluor 488). Los ensayos proporcionaron una sólida herramienta bioquímica para medir las interacciones patógeno-inmunorreceptor, superando las dificultades asociadas con las líneas celulares transgénicas y los experimentos de modulación de la expresión génica de proteínas.
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Se generaron extractos de proteínas celulares totales de macrófagos humanos, que luego se incubaron con células completas de M. tuberculosis (WCMtb) o antígenos de M. tuberculosis (Ag Mtb) durante la noche a 4 °C y finalmente se entrecruzaron mediante un tratamiento con formaldehído/glicina/etilenglicol bis (succinimidil succinato). La interacción de SLAMF1 con WCMtb mediante citometría de flujo se detectó con un anticuerpo anti-SLAMF1 PE. La existencia de interacción mediante microscopía de fluorescencia se determinó mediante la fijación de Ags de Mtb teñidos con rodamina-PE a cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, que se incubaron con el extracto proteico total de macrófagos derivados de monocitos. Tras el tratamiento de entrecruzamiento, se visualizó SLAMF1 mediante anticuerpos primarios (anti-SLAMF1) y secundarios (Alexa Fluor 488). Los ensayos proporcionaron una sólida herramienta bioquímica para medir las interacciones patógeno-inmunorreceptor, superando las dificultades asociadas con las líneas celulares transgénicas y los experimentos de modulación de la expresión génica de proteínas. The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic strains and genetically engineered cells. Here, an alternative method to detect biochemical interaction between the macrophage microbial sensor SLAMF1 and Mycobacterium tuberculosis is described. Two technical approaches employing flow cytometry and fluorescence microscopy were developed. Total cell protein extracts from human macrophages were generated, then incubated with whole cells of M. tuberculosis (WCMtb) or M. tuberculosis antigens (Mtb Ags) overnight at 4 °C and finally cross-linked using formaldehyde/glycine/ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) treatment. SLAMF1 interaction with WCMtb by flow cytometry was detected with a PE-specific anti-SLAMF1 antibody. The existence of interaction by fluorescence microscopy was performed by attaching Rhodamine-PE stained Mtb Ags to poly-D-lysine coated slides, which were incubated with the total protein extract from monocyte-derived macrophages. After cross-linking treatment, SLAMF1 was visualized using primary (anti-SLAMF1) and secondary (Alexa Fluor 488) antibodies. The assays provided a strong biochemical tool to measure pathogen-immunoreceptor interactions, overcoming the difficulties associated with transgenic cell lines and protein gene expression modulation experiments. Fil: Barbero, Angela María. Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas; Argentina. Fil: Barbero, Angela María. Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires; Argentina. Fil: Hernández Del Pino, Rodrigo Emanuel. Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas; Argentina. Fil: Hernández Del Pino, Rodrigo Emanuel. Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires; Argentina. Fil: García, Verónica Edith. Universidad de Buenos Aires. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Fil: García, Verónica Edith. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Pasquinelli, Virginia. Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas; Argentina. Fil: Pasquinelli, Virginia. Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires; Argentina. Con referato 2025-07-15T16:55:52Z info:eu-repo/date/embargoEnd/2027-07-31 2025-07-15T16:55:52Z 2025-02-28 info:eu-repo/semantics/article info:ar-repo/semantics/artículo info:eu-repo/semantics/publishedVersion info:eu-repo/semantics/article info:ar-repo/semantics/artículo info:eu-repo/semantics/publishedVersion info:eu-repo/semantics/article info:ar-repo/semantics/artículo info:eu-repo/semantics/publishedVersion Barbero, A.M., Hernández Del Pino, R.E., García, V.E., Pasquinelli, V. (2025). Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1, 216. doi:10.3791/67745 1940-087X http://repositorio.unnoba.edu.ar/xmlui/handle/23601/927 eng info:eu-repo/grantAgreement/UNNOBA/SIB/0618/2019/AR. Junín/Diagnóstico molecular y respuesta inmune frente a la infección por Clostridioides difficile, un patógeno emergente/SIB0618/2019 info:eu-repo/grantAgreement/UNNOBA/SIB/2582/2012/AR. Junín/ SLAM: ¿un nuevo sensor microbiológico en la infección por micobacterias?/ SIB2582/2012 info:eu-repo/grantAgreement/ ANPCyT/PICT/2012-2459/AR. Ciudad de Autónoma de Buenos Aires/Rol de SLAM como un sensor microbiológico de los macrófagos en la infección por micobacterias./PICT-2012-2459 info:eu-repo/grantAgreement/ ANPCyT/PICTA/ 2017-1896 /AR. Ciudad de Autónoma de Buenos Aires/ Regulación epigenética del IFNG y su impacto en la respuesta inmune frente a Mycobacterium tuberculosis./PICT-A-2017-1896 info:eu-repo/grantAgreement/ ANPCyT/PICT/ 2021-I-INVI-00584/AR. Ciudad de Autónoma de Buenos Aires/Eje intestino-pulmón en la defensa del hospedador frente a infecciones bacterianas. Impacto de la infección causada por Clostridioides difficile sobre las respuestas de los macrófagos frente a Mycobacterium tuberculosis./PICT-2021-I-INVI-00584 info:eu-repo/grantAgreement/ CONICET – UNNOBA/PIO/15720150100010CO /AR. 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