Cultivo de células de la granulosa humanas para el análisis de los efectos del disruptor endocrino di(2-etilhexil) ftalato

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La exposición a disruptores endocrinos (DE) representa una preocupación global debido a sus efectos adversos sobre la salud reproductiva. DE cómo el di(2-etilhexil) ftalato (DEHP) se han detectado en el líquido folicular, sugiriendo un posible impacto directo en la función de las células de la gra...

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Autores principales: Perez, PA, Fux-Otta, C, Marconetto, A, Costamagna, P, Babini, AM, Cáceres, O, Mukdsi , JH, Gutierrez, S
Formato: Artículo revista
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad Nacional Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Secretaria de Ciencia y Tecnología 2025
Materias:
DEHP
human granulosa Cells
Estradiol
progesterone
in vitro
células de la granulosa
progesterona
Acceso en línea:https://revistas.unc.edu.ar/index.php/med/article/view/50485
Aporte de:
Revista de la Facultad de Ciencias Médicas de Córdoba de Universidad Nacional de Córdoba
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description La exposición a disruptores endocrinos (DE) representa una preocupación global debido a sus efectos adversos sobre la salud reproductiva. DE cómo el di(2-etilhexil) ftalato (DEHP) se han detectado en el líquido folicular, sugiriendo un posible impacto directo en la función de las células de la granulosa humanas (CGH), cruciales para la maduración folicular y la fertilidad femenina. Considerando la complejidad de obtener y mantener cultivos primarios de CGH, se propuso desarrollar y caracterizar un modelo de cultivo de CGH obtenidas de tratamientos de reproducción asistida para el análisis de los efectos del DEHP. Se obtuvieron CGH de 10 mujeres sometidas a punción ovárica. Las mismas fueron lavadas (DMEM/Ham F-12), centrifugadas a 1000 rpm y sembradas en cubreobjetos de 22 mm sobre placas de 24 wells. Después de 3 días de cultivo fueron estimuladas con DEHP 0 - 1 y 10 nM por 24h, levantadas y procesadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión. Se determinó estradiol y progesterona en el medio de cultivo mediante quimioluminiscencia. El análisis estadístico fue descriptivo, cuantificando los efectos observados mediante porcentajes. El análisis morfológico óptico y electrónico mostró CGH control con una morfología conservada, núcleos ovoides, nucléolos prominentes, gránulos secretorios abundantes esparcidos por el citoplasma y sistema de endomembranas bien desarrollado. La exposición a ambas dosis de DEHP no modificó la morfología celular. Además, se detectó secreción hormonal, cuantificando estradiol (166-405 pg/mL) y progesterona (7.8-267.7 ng/mL) en todas las muestras cultivadas, indicando que las células mantuvieron su función esteroidogénica in vitro. DEHP modificó los niveles de secreción hormonal, observándose un incremento o disminución, sin un patrón claro, posiblemente debido al bajo número muestral. Los resultados demuestran que el protocolo de cultivo utilizado fue consistente y fiable para mantener las CGH in vitro, preservando sus características morfológicas y funcionales, incluyendo su capacidad esteroidogénica. Aunque la exposición a DEHP no alteró la morfología celular, modificó los niveles secretorios, sin un patrón definido, posiblemente debido al tamaño muestral limitado. Este modelo representaría una herramienta valiosa para futuras investigaciones sobre el impacto de contaminantes sobre la fisiología de las CGH y los mecanismos subyacentes de la infertilidad femenina.
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Considerando la complejidad de obtener y mantener cultivos primarios de CGH, se propuso desarrollar y caracterizar un modelo de cultivo de CGH obtenidas de tratamientos de reproducción asistida para el análisis de los efectos del DEHP. Se obtuvieron CGH de 10 mujeres sometidas a punción ovárica. Las mismas fueron lavadas (DMEM/Ham F-12), centrifugadas a 1000 rpm y sembradas en cubreobjetos de 22 mm sobre placas de 24 wells. Después de 3 días de cultivo fueron estimuladas con DEHP 0 - 1 y 10 nM por 24h, levantadas y procesadas para microscopía óptica y electrónica de transmisión. Se determinó estradiol y progesterona en el medio de cultivo mediante quimioluminiscencia. El análisis estadístico fue descriptivo, cuantificando los efectos observados mediante porcentajes. El análisis morfológico óptico y electrónico mostró CGH control con una morfología conservada, núcleos ovoides, nucléolos prominentes, gránulos secretorios abundantes esparcidos por el citoplasma y sistema de endomembranas bien desarrollado. La exposición a ambas dosis de DEHP no modificó la morfología celular. Además, se detectó secreción hormonal, cuantificando estradiol (166-405 pg/mL) y progesterona (7.8-267.7 ng/mL) en todas las muestras cultivadas, indicando que las células mantuvieron su función esteroidogénica in vitro. DEHP modificó los niveles de secreción hormonal, observándose un incremento o disminución, sin un patrón claro, posiblemente debido al bajo número muestral. Los resultados demuestran que el protocolo de cultivo utilizado fue consistente y fiable para mantener las CGH in vitro, preservando sus características morfológicas y funcionales, incluyendo su capacidad esteroidogénica. Aunque la exposición a DEHP no alteró la morfología celular, modificó los niveles secretorios, sin un patrón definido, posiblemente debido al tamaño muestral limitado. Este modelo representaría una herramienta valiosa para futuras investigaciones sobre el impacto de contaminantes sobre la fisiología de las CGH y los mecanismos subyacentes de la infertilidad femenina. Endocrine disrupting chemicals (EDCs) exposure pose a global concern due to their adverse effects on reproductive health. EDCs such as di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) have been detected in follicular fluid, suggesting a potential direct impact on the function of human granulosa cells (HGCs), which are crucial for follicular maturation and female fertility. Given the complexity of obtaining and maintaining primary HGC cultures, the development and characterization of an HGC culture model from assisted reproduction treatments was proposed to analyze the effects of DEHP. HGCs were obtained from 10 women undergoing ovarian puncture. The cells were washed (DMEM/Ham F-12), centrifuged at 1000 rpm, and seeded on 22 mm coverslips in 24-well plates. After 3 days of culture, they were stimulated with DEHP at concentrations of 0, 1, and 10 nM for 24 hours, lifted, and processed for optical and transmission electron microscopy. Estradiol and progesterone levels in the culture medium were determined by chemiluminescence. The statistical analysis was descriptive, quantifying the observed effects using percentages. Optical and electron morphological analysis showed control of HGCs with a preserved morphology, ovoid nuclei, prominent nucleoli, abundant secretory granules scattered throughout the cytoplasm, and a well-developed endomembrane system. Exposure to both DEHP doses did not alter cell morphology. Additionally, hormone secretion was detected, with estradiol (166-405 pg/mL) and progesterone (7.8-267.7 ng/mL) being quantified in all cultured samples, indicating that the cells maintained their steroidogenic function in vitro. DEHP modified hormone secretion levels, with either an increase or decrease observed, without a clear pattern, possibly due to the low sample number. The results show that the culture protocol used was consistent and reliable for maintaining HGCs in vitro, preserving their morphological and functional characteristics and including their steroidogenic capacity. Although exposure to DEHP did not alter cell morphology, it did modify secretory levels without a defined pattern, likely due to the limited sample size. This model would represent a valuable tool for future research on the impact of contaminants on HGC physiology and the underlying mechanisms of female infertility. Universidad Nacional Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Secretaria de Ciencia y Tecnología 2025-11-12 info:eu-repo/semantics/article info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf https://revistas.unc.edu.ar/index.php/med/article/view/50485 10.31053/1853.0605.v82.n.50485 Revista de la Facultad de Ciencias Médicas de Córdoba.; Vol. 82 (2025): Suplemento JIC XXVI Revista de la Facultad de Ciencias Médicas de Córdoba; Vol. 82 (2025): Suplemento JIC XXVI Revista da Faculdade de Ciências Médicas de Córdoba; v. 82 (2025): Suplemento JIC XXVI 1853-0605 0014-6722 spa https://revistas.unc.edu.ar/index.php/med/article/view/50485/50601 Derechos de autor 2025 Universidad Nacional de Córdoba https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0

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