Comportamiento bioquímico e inmunogénico de antígenos de Fasciola Hepática
Tesis (Dr. en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 1995.
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2024
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I10-R141-11086-5535412024-09-07T06:23:21Z Comportamiento bioquímico e inmunogénico de antígenos de Fasciola Hepática Cervi, Laura Alejandra Masih, Diana Teresa Riera, Clelia María Vides, Miguel Angel Montamat, Enrique Eduardo Inmunología Fasciola hepatica Tesis (Dr. en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 1995. Fil: Cervi, Laura Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica; Argentina. Fil: Cervi, Laura Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fasciola hepatica (Linneo, 1758) es un parásito trematodes digenético, de forma foliácea de 1 a 3 cm de longitud, que se localiza en canalículos biliares de ganado ovino, bovino, caprino y eventualmente en el hombre. Posee un ciclo biológico complejo que se inicia con la postura de huevos no embrionados que llegan con la bilis al intestino de los huéspedes definitivos y por medio de la materia fecal al exterior. Su desarrollo continúa en el agua cuando el miracidio abandona el huevo y penetra en un caracol del género Lininaea donde se reproduce. La forma evolutiva que abandona al caracol son las cercanas que se enquistan en las hierbas que crecen en el agua, adhiriéndose a sus hojas. La forma infectante es la metacercaria adherida a Nasturtiurn officinale (vulgarmente berros). La evolución de este helminto solo continúa si la metacercaria es ingerida por el huésped definitivo, en cuyo intestino se desenquista quedando en libertad el distoma joven el cual atraviesa la pared intestinal y cae a la cavidad peritoneal. Luego de atravesar la cápsula de Glisson penetra en el parénquima hepático migrando hasta su localización en los conductos biliares donde alcanza el estado adulto dos meses después de la infección (1). Durante la migración por peritoneo el parásito produce microabscesos con infiltrado leucocitario. Cuando se aloja en hígado aparecen focos necróticos, fibrosis, infiltrado linfocitario e hiperpiasia de los conductos biliares, pudiendo producir cirrosis hepática. Una de las caracterísicas de este parásito como la mayoría de las parasitosis, es la posibilidad de su larga permanencia en el huésped sin que sea afectada su viabilidad. Esta prolongada permanencia del parásito en el huésped determina una constante estimulación del sistema inmune que puede generar mecanismos que inducen protección o supresión del mismo. Entre los mecanismos generales efectores contra parásitos se encuentra la activación de macrófagos por linfoquinas, lo que induce la formación de mas receptores para Fc de la IgG y para el C3b del complemento y estimula la producción y secreción de varias enzimas y otros factores, incluyendo metabolitos del oxígeno que en último termino convierten a los macrófagos en citotóxicos para los parásitos. Estos mecanismos son de gran importancia en el control de las infecciones causadas por parásitos intracelulares (Trypanosoma cruzi, y Plasmodium) (2, 3). El rol de los anticuerpos y el complemento en estas infecciones parasitarias es relevante, por ejemplo en esporozoitos de Plasmodium se ha observado una lesión directa o lisis mediada por anticuerpos que activan la vía clásica del complemento, causando lesiones en la membrana del parásito y aumentando la sensibilidad a otros mediadores (4). En merozoitos del mismo parásito y en T cruz¡ y Toxoplasma gondii, los anticuerpos bloquean el sitio de unión del parásito con el receptor de la célula a la cual invaden, neutralizando el sitio de unión y evitando la multiplicación (5). También se ha observado en tripanosomiasis por T cruzi una intensificación de la fagocitosis por una mayor opsonización a través del C3b del complemento en la membrana de los mismos (6). La hipergamaglogulinemia observada en muchas infecciones parasitarias extracelulares probablemente se deba a los antígenos liberados por el parásito, que actúan como mitógenos policlonales para las células B(7). En helmintos los eosinófilos parecen ser una célula efectora fundamental mediante un mecanismo de citotoxicidad dependiente de anticuerpos, como ocurre con Schistosorna mansoni; este parásito libera factores quimiotácticos para los eosinófilos, los cuales se asocian a anticuerpos específicos y ejercen la citotoxicidad sobre el parásito (8). En los nematelmintos un mecanismo de importancia, es la liberación de factores inespecíficos por las células T, los cuales producen un aumento en el número de células inflamatorias, mastocitos y células caliciformes. En presencia de anticuerpos la expulsión de los helmintos envueltos en mucus es efectuada a las pocas semanas de la infección por la actividad muscular que acompaña al aumento de secreción, como en el caso de Trichinella spira/is (9, 10). Es posible suponer que el parásito que sobrevive en el huésped y a sus expensas a pesar de la respuesta inmune que genera, posee mecanismos in vivo que le permiten la evasión de la acción de los anticuerpos y de las células sensibilizadas. Entre los mecanismos generales que utilizan los parásitos en la evasión de la respuesta inmune se encuentran los diferentes medios por los cuales los protozoarios intracelulares son capaces de multiplicarse dentro de los macrófagos, escapando de la digestión por enzimas lisosómicas. Se ha demostrado que T gondii, inhibe la fusión de los lisosomas secundarios con las vacuolas fagosómicas, por lo cual el parásito vivo no esta expuesto a la acción de las enzimas lo que permite su multiplicación y sobrevida. En tripanosomiasis por el T. cruzi, los tripomastigotes escapan de la vacuola fagosómica y se dividen dentro del citoplasma, mientras que Leishmania sp. se divide dentro de la vacuola fagocítica donde resiste la digestión (11, 12 ). La variación antigénica es otra estrategia usada por los tripanosomas africanos para evitar la respuesta inmune del huésped según la cual cada variante del parásito presenta diversidad en las glicoproteínas de superficie, por lo cual los anticuerpos sintetizados contra las diferentes variantes no son protectivos (13). En Plasmodium yoelii se ha demostrado una disminución de las células productoras de anticuerpos proporcional al aumento en la parasitema durante el curso de la infección (4). También puede producirse supresión específica, como se ha demostrado en leishmaniasis, en la cual la depresión esta mediada por células T supresoras, que inhiben la hipersensibilidad tardía pero no la producción de anticuerpos (14). En helmintos como S. mansoni, se ha observado un fenómeno de enmascaramamiento de las esquistosómulas, las cuales se cubren de antígenos del huésped como determinantes de grupos sanguíneos A, B y O y también antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad, para protegerse del ataque de los anticuerpos (15). También pueden producir supresión de la respuesta inmune, las larvas jovenes de T. spiralis que liberan un factor linfocitotóxico soluble. De manera similar, las esquistosómulas pueden escindir un péptido de las IgG inhibiendo diversas respuesta inmunes celulares (16). Recientemente, se han propuesto distintos mecanismos para explicar la inmunorregul ación supresora observada en distintas enfermedades producidas por parásitos, como en malaria (17, 18), schistosomiasis (19), y tripanosomiasis (20, 21, 22). Dichos procesos inmunosupresivos influyen en el huésped tornando inefectiva la respuesta inmune contra estos parásitos (23, 24,25). Los parásitos helmintos son organismos metazoarios complejos que tienen como huéspedes a mamíferos dentro de los cuales sufren cambios en su estructura y comportamiento, durante la migración a través de los fluídos y tejidos del huésped. La complejidad de los mismos y de sus ciclos biológicos, está reflejada en la variedad de moléculas excretadas-secretadas. Difieren sustancialmente de los protozoarios y agentes patógenos microbianos, ya que ellos se presentan al huésped como un objeto extraño, amplio, no-fagocitable. El tamaño de estos parásitos también influye en las estrategias que usan para evitar el ataque inmune, con una variedad de mecanismos que han evolucionado para capacitarlo en la evasión o modulación de la respuesta inmune. Los productos excretores-secretores de los helmintos pueden producir estimulación antigénica lo que conduce a una respuesta inmune protectiva, expresada por la muerte y/o expulsión de los parásitos, como asi también el desarrollo de inmunidad concomitante. Alternativamente los productos excretores-secretores de los helmintos podrían permitir al parásito evitar los efectos de la respuesta inmune del huésped (26). Se ha definido claramente el potencial de los productos excretoressecretores, en la contribución de la evasión inmune de los parásitos que viven tanto en los tejidos como en los fluídos del huésped. Estos mecanismos, demostrados in vitro, para algunos helmintos incluyen evasión de la respuesta inmune principalmente a través del desprendimiento de los componentes de la superficie del parásito y supresión en la función de los linfocitos, macrófagos o granulocitos (26). Badley y col. (27) investigaron la relación entre los antígenos excretoressecretores desprendidos de la superficie y la respuesta inmune a larvas de Toxocara cafÉs. Estos autores demostraron que la absorción de suero inmune con productos excretores-secretores de la larva simultáneamente eliminó la capacidad del suero de mediar la adherencia de eosinófilos y removió los anticuerpos específicos dirigidos contra la superficie de la larva. De este modo protege a la misma de las toxinas de los eosinófilos evitando el íntimo contacto con la superficie del parásito vivo. Los productos excretores secretores de Taenia laenlaeformis mostraron efectos inhibitorios sobre la función de linfocitos in vitro a través de la inducción de una población de células supresoras (28). Una proteinasa de T. taeniaeforrnis también mostró actividad supresora de linfocitos bloqueando la generación de IL-2 e IL-1, las cuales median la activación de las células del huésped (29). También factores liberados durante la transformación de las cercanas de S. niansoni a schistosómulas, han demostrado que ejercen un efecto inhibitorio sobre la respuesta proliferativa de células mononucleares de sangre periférica a fitomitógenos (30). Estos factores también pueden modular la reactividad de linfocitos a través de la presencia de epitopes relacionados a fosforilcolina, la cual ha sido propuesta como inhibitoria de algunas poblaciones de células B específicas (3 1). Las funciones de los mastocitos pudieron ser inhibidas por factores liberados por los productos excretores secretores de gusanos adultos de S. mansoni (32), también estos factores han mostrado indirectamente la inhibición de la función de macrófagos, ya que las enzimas secretadas por el parásito clivaron la inmunoglubulina G y los péptidos productos de la hidrólisis inhibieron la estimulación de macrófagos en ensayos de fagocitosis (33). Algunos autores han demostrado la modificación de las funciones de las células accesorias por acción de productos liberados por helmintos. Rakha y col. (34) demostraron que macrófagos murinos incubados con determinadas fracciones de los factores liberados por Taenia rnulticeps, causan una progresiva inhibición en la transformación de linfocitos, esto constituiría un potencial mecanismo para limitar la respuesta inmune del huésped in vivo. Este mismo autor inyectando un factor parcialmente purificado secretado por la larva de Echinococcus multilocularis, observa la modificación de las funciones de las celulas accesorias de ratones normales, como asi también en ratones infectados con el parásito (35). En E. hepatica los productos excretores-secretores se encuentran en el tegumento del parásito, que está constituido por un sincicio superficial anucleado, unido apical y basalmente por una membrana plasmática y conectado por medio de tubos citoplamáticos con células tegumentales ubicadas profundamente por debajo de la capa muscular superficial (36). Bennett y Threadgold (37) han descripto la evolución del tegumento de E hepatica en ratones infectados desde el desenquistamiento de la metacercaria en intestino hasta el estado adulto en los conductos biliares. Existen dos tipos de células tegumentales de distinto origen embrionario que difieren en la naturaleza de las vesículas secretorias producidas por sistema Retículo endoplásmico/Golgi, las células tipo O que luego se diferencian en células tipo 1 y las células tipo 2 que provienen de diferenciación embrionaria del parénquima. Las células tipo O producen vesículas esferoidales de membrana densa de 0,22 Vtm denominadas vesículas VO, las células tipo 1 producen vesículas similares de 0.12 tm, denominadas VI mientras que células tipo 2 producen vesículas bicóncavas de 0.20 pun denominadas V2. Las vesículas secretorias pasan continuamente a la superficie sincicial del tegumento a través de los conductos tegumentales (38). En la metacercaria y en las formas mas juveniles, las células tegumentales son todas tipo O con vesículas que se encuentran densamente empaquetadas en el tegumento de la metacercaria; en el gusano juvenil se trasladan a la superficie del sincicio. Cuando el gusano juvenil penetra en el hígado del huésped sus células tipo O se diferencian en células tipo 1 típica de esta forma evolutiva y comienzan a producir vesículas VI. En el momento en que el gusano atraviesa el hígado del huésped, comienzan a acumularse en el citoplasma apical vesículas V2 típicas del adulto. Cuando el gusano esta localizado en los conductos biliares todas las vesículas son V2. Se cree que los productos de excreción-secreción contenidos en las vesículas estan involucrados en la protección del mismo por el mecanismo de exposición y desprendimiento del glicocalix mas externo y el reemplazo por el contenido de una nueva vesícula. Esto ha sido propuesto como un mecanismo de evasión de la respuesta inmune, ya que los anticuerpos sintetizados contra el contenido de las vesículas secretorias junto con el glicocálix son desprendidos del parásito y reemplazados por la secreción de vesículas de un estadío mas avanzado, impidiendo de esta manera la acción de los anticuerpos sintetizados (39). Otra estrategia de evasión inmune para E. hepatica fue descripta por Duffus y Frank (40) quienes demostraron un mecanismo de prevención del parásito contra el ataque de los granulocitos, en especial eosinófilos, mediante la excreción del glicocálix externo acomplejado con anticuerpos específicos, evadiendo el daño mediado por células, ya que deja sin efecto la unión granulocito-anticuerpo-antígeno, evitando la degranulación sobre el parásito. Chapman y Mitchell (41), y Heffernan y col. (42) demostraron que E. hepatica inmadura libera una enzima similar a papaína o catepsina B que actúa como enzima proteolítica clivando inmunoglobulinas de ratón, rata, conejo y oveja. El clivaje es solo parcial, sin embargo logra hacer menos efectivo el sistema de defensa del huésped. Una de las principales limitaciones para el estudio de la respuesta inmune específica es la ausencia de conocimientos sobre antígenos definidos del parásito. Algunos investigadores (43, 44, 45) han aislado fracciones antigénicas para ser usadas en serodiagnóstico en fasciolosis. Pero para poder examinar la asociación entre la estructura del antígeno y la respuesta inmune engendrada, se requiere de una caracterización bioquímica de los antígenos, los cuales podrían producir estimulación o supresión del sistema inmune.. Productos metabólicos de E. hepatica han sido usados como una fuente potencial de antígenos para uso en inmunodiagnóstico en modelos experimentales con conejos y en la infección natural de ovejas y cabras. Cuperlovic y Lalic (46), demostraron por fijación de complemento la presencia de anticuerpos contra antígenos metabólicos de E. hepatica que aparecen en la circulación de animales infectados antes que los hallazgos clínicos y coproparasitológicos fueran observados. Pfister y col. (47) evaluaron tres preparaciones de antígenos somáticos y tres de excretores-secretores usando sueros de conejos infectados experimentalmente y ovejas infectadas naturalmente detectando anticuerpos contra fracciones del antígeno excretor-secretor en estadíos tempranos de la infección. Irving y Howell (48) detectaron en medio de cultivo de larvas juveniles de E. hepatica incubadas con leucina (C 4), tres componentes antigénicos polipeptídicos principales de 23, 24 y 26 kDa. Por otra parte, Rivera Manero y col. (49) identificaron en fasciolosis temprana en ratas componentes antigénicos de los productos excretores-secretores de alto PM (150-160 kDa). En trabajos de Norden y Strand (50) se demostró que el suero de ovejas con distomatosis (infectadas naturalmente) incubado con glicoproteínas de E. hepatica marcada con S35 precipitaron 7 glicoproteínas de PM comprendido entre 30 y 70 kDa. En estudios posteriores de rnmunoprecipitación Aronstein y col. (51), utilizando sueros de conejos de 9 semanas de infección identificaron 7 glicoproteínas con un rango de 30-70 kDa. Recientemente Poitou y col (52) encontaron que los anticuerpos de ratas infectadas con E hepatica reconocieron 8 fracciones proteicas con un rango de PM comprendido entre 22.5 y 115 kDa. Estos autores 6 observaron un incremento en el número de fracciones proteicas reconocidas por sueros de ratas durante el curso de la infección, lo que sugiere una progresiva liberación de estos antígenos en diferentes etapas de maduración del parásito. Las proteínas de 22.5 y 115 kDa fueron detectadas durante toda la evolución del parásito, sugiriendo que estos serían epitopes comunes entre los gusanos juveniles y adultos. Estos resultados son similares a los obtenidos por Sexton y col. (53) quienes detectaron esos antígenos en las formas maduras e inmaduras del parásito utilizando suero de ovejas infectadas. Por otra parte, se ha demostrado la presencia de antígenos excretores-secretores del parásito en circulación en distomatosis murina (54) y humana (55). Diferentes mecanismos que involucran estos productos, han sido propuestos para explicar la habilidad del parásito, para evadir la respuesta inmune del huesped. Recientemente algunos autores han detectado diferentes componentes antígenicos en los productos excretores-secretores de F.hepatica (84), como así también han reportado la purificación parcial (85) y la identificación de fracciones antigenicas de estos productos con especificidad para fasiolosis (86, 87). Sin embargo poco se conoce a cerca de como estos productos liberados por el parásito modularían las funciones de las células accesorias, como así también la respuesta inmune (mediada por Li T) tanto a antígenos propios como a extraños. En base a estos antecedentes el objetivo de este trabajo fue conocer la participación de los productos excretores-secretores de Fasciola hepatica en la modulación de la respuesta inmune celular inducida en ratas por un homogenato total del parásito. Para ello se estudió: • Algunos aspectos de la composición química y antigénica de los productos excretores-secretores de E. hepatica en relación al homogenato total del parásito. • La influencia de los productos excretores-secretores de E. hepatica en la modulación de las principales funciones de las células accesorias peritoneales. • El efecto de los productos excretores-secretores de E. hepatica en la modulación de la respuesta mediada por Li T a antígenos del parásito y a antígenos no relacionados utilizando en este último caso albúmina sérica humana (ASH). Fil: Cervi, Laura Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica; Argentina. Fil: Cervi, Laura Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. 2024-09-06T20:06:08Z 2024-09-06T20:06:08Z 1995 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/553541 spa Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |