Análisis de la inmunidad específica y de amplio espectro : caracterización y evaluación funcional de genes candidatos para la obtención de cultivos resistentes a bacterias fitopatógenas
Los agentes fitopatógenos son uno de los principales desafíos que afectan la producción agrícola. Bacterias como Pseudomonas syringae (P. syringae) y Candidatus Liberibacter (Ca. Liberibacter) son dos de los principales agentes bacterianos que afectan los rindes agrícolas. En la actualidad existen p...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | , , , , , |
| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
15 de octubre del 2025
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| Materias: | |
| Aporte de: | Registro referencial: Solicitar el recurso aquí |
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| 245 | 1 | 0 | |a Análisis de la inmunidad específica y de amplio espectro : |b caracterización y evaluación funcional de genes candidatos para la obtención de cultivos resistentes a bacterias fitopatógenas |
| 246 | 3 | 1 | |a Analysis of specific and broad-spectrum immunity : |b characterization and functional evaluation of candidate genes for the development of crops resistant to phytopathogenic bacteria |
| 260 | |c 15 de octubre del 2025 | ||
| 300 | |a xviii, 157 p. : |b il., fotos color, gráfs. color, tablas | ||
| 502 | |b Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |c Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |d 2025-10-15 |g Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - CONICET. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular (IABIMO) | ||
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| 518 | |o Fecha de publicación en la Biblioteca Digital FCEN-UBA | ||
| 520 | 3 | |a Los agentes fitopatógenos son uno de los principales desafíos que afectan la producción agrícola. Bacterias como Pseudomonas syringae (P. syringae) y Candidatus Liberibacter (Ca. Liberibacter) son dos de los principales agentes bacterianos que afectan los rindes agrícolas. En la actualidad existen pocos métodos económicamente viables para controlar a los agentes bacterianos. Entre las estrategias disponibles se encuentra el mejoramiento genético mediante la introgresión de genes de resistencia (ya sean de origen exógeno o endógeno), con una expresión aumentada. En este punto es importante resaltar que las bacterias co-evolucionan con sus hospedadores, por lo cual es deseable desarrollar cultivos mediante el apilamientos de genes y que generen tolerancia o resistencia durable y que afecte a una gran proporción de agentes fitopatógenos. A partir de este trabajo, se analizaron genes de inmunidad específica, así como genes de amplio espectro ya que, de poder generarse el apilamiento de genes, sería interesante hacer un uso combinado de ambas estrategias inmunitarias. Para evaluar la inmunidad específica se seleccionaron genes a partir de una aproximación experimental derivada de la transcriptómica. Específicamente, se seleccionó (para su evaluación) la familia de proteínas ATG1 (Autophagy Related Gene 1, del inglés). Se determinó que dos genes candidatos de esta familia se encuentran inducidos durante la respuesta inmune frente a P. syringae en plantas de Solanum lycopersicum (S. lycopersicum, tomate). La familia ATG1 consta de tres y cinco miembros en S. lycopersicum y en N. benthamiana, respectivamente. Por lo que es una familia pequeña de proteínas, lo que la hace óptima para hacer su caracterización funcional mediante silenciamiento génico transitorio. A partir de plantas silenciadas de Nicotiana benthamiana (N. benthamiana), especie modelo, se estudió la respuesta de ATG1 dependiente de la interacción AvrPto-Pto. Esta interacción de proteínas, que ocurre en grandes concentraciones debido a su sobreexpresión, permite magnificar la Respuesta Hipersensible para poder visualizarla (HR, del inglés Hipersensitive Response). A partir de ello, se determinó que las plantas silenciadas con distintas construcciones presentan retrasada esta respuesta. Luego, en plantas N. benthamiana sobreexpresando Pto se infectó con P. syringae pv. tabaci (Ps tab) expresando o no el efector AvrPto, en condiciones similares a las naturales. No se observó el correspondiente adelanto de la sintomatología de enfermedad (como era de esperar en un patosistema incompatible dependiente de la misma interacción entre el efector y la proteína de reconocimiento). Adicionalmente, se observó un retraso de la sintomatología de enfermedad en un sistema compatible. Para agregar complejidad, se evaluó el crecimiento bacteriano empleando las mismas infecciones con Ps tab. Y a partir del recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en plantas silenciadas, utilizando las mismas condiciones de infección que en el ensayo de enfermedad, el sistema incompatible no presentó diferencias con respecto al control, comparable a lo observado en el ensayo de enfermedad. En contraposición, en el sistema compatible, se observó un aumento de la concentración bacteriana en las plantas silenciadas. Además, los resultados indican que podría verse afectada la senescencia. Tomados como conjunto, estos hallazgos sugieren fuertemente una hipótesis que implicaría un proceso simultáneo de autofagia que podría estar interviniendo en paralelo, lo que explicaría razonablemente los resultados observados. En relación con los genes de amplio espectro, se han descripto en la bibliografía diversos péptidos antimicrobianos (AMPs). Una familia de proteínas que presenta propiedades de AMPs es la familia de SNAKIN/GASA. Esta familia consta de tres subfamilias y cuenta con múltiples miembros cuya actividad ha sido probada en diversas especies vegetales frente a fitopatógenos de origen bacteriano, viral y fúngico. Previo a esta tesis, se construyó un árbol filogenético a partir de secuencias obtenidas de siete híbridos de cítricos, con el objetivo de identificar las subfamilias SNAKIN/GASA reportadas en la bibliografía. De este análisis se confirmó la presencia de los dominios de esta familia y clasificó según las tres subfamilias descriptas. Para completar el mismo, en esta tesis se incluyeron las secuencias de Solanum tuberosum (S. tuberosum), dado que han sido ampliamente estudiadas en el instituto. A partir de ello, se encontró un alto grado de identidad de secuencias y se confirmó la relación de ortología. En particular, los miembros de cítricos GASA6, GASA8 y GASA10, son ortólogos de StSN1, StSN2 y StSN3, respectivamente. Cada una correspondiente a una de las tres subfamilias. Bajo la hipótesis de que los tejidos juveniles, más aún los reproductivos, presentan mayor tolerancia a enfermedades y asegurar la descendencia fértil, se analizó la expresión absoluta de diez genes de la familia SNAKIN/GASA de los tejidos de flor, hoja joven y madura, provenientes de cinco variedades de cítricos con distinto grado de tolerancia/resistencia a enfermedades, obtenidas de una estación experimental. En el mismo se incluyó al menos un representante de cada subfamilia, para realizar un análisis de expresión génica en distintos tejidos, entre ellos los previamente mencionados GASA6, GASA8 y GASA10. A partir de ello, se seleccionaron estos tres genes para realizar la caracterización funcional. Con este objetivo, se sobreexpresaron transitoriamente en N. benthamiana los genes PtGASA6, PtGASA8 y PtGASA10, provenientes de Poncirus trifoliata (P. trifoliata), una variedad de portainjerto reconocida por su mayor grado de tolerancia a enfermedades. Se desarrollaron sistemas novedosos de infección que permitieran sobreexpresar los genes y poder vislumbrar sintomatología de enfermedad y de HR utilizando plantas de N. benthamiana. Con ese enfoque se emplearon dos bacterias: Ps tab y Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), de forma de obtener un patosistema compatible, así como otro incompatible, respectivamente, y permitir una evaluación integral de la respuesta inmunitaria. A su vez, Xcc, es la bacteria modelo de estudio en cítricos. Dos de estos genes presentaron resultados muy alentadores, PtGASA6 y PtGASA10. Luego de su sobreexpresión, ambos genes produjeron un retraso en la sintomatología de enfermedad, así como un adelanto de la HR. Esto indicaría que la expresión incrementada de estos genes podría intervenir reduciendo la enfermedad, así como adelantando la HR. No obstante, cabe resaltar que PtGASA6 tuvo un efecto más marcado en el adelanto de la HR, mientras que PtGASA10 causó un mayor efecto en el retraso de la enfermedad. Debido a que ambos presentaron resultados alentadores, pero con distintos grados de influencia sobre la inmunidad, es probable que el mecanismo de acción difiera entre ellos. Sería interesante evaluar sus efectos dentro de la planta y determinar si tienen la capacidad de desplazarse fuera de la célula vegetal, considerando que Ca. Liberibacter se encuentra en el sistema vascular. A partir de estos resultados, se puede hipotetizar que ambos genes serían candidatos prometedores para ser introgresados en cítricos por cruzamiento genómicamente asistido o mediante ingeniería genética con el fin de desarrollar cultivos intragénicos. |l spa | |
| 520 | 3 | |a Phytopathogenic bacteria are among the main challenges affecting agricultural production. Bacteria such as Pseudomonas syringae (P. syringae) and Candidatus Liberibacter (Ca. Liberibacter) are two of the most significant bacterial agents impacting crop yields. Currently, there are few economically viable methods to control bacterial pathogens. Among the available strategies is genetic breeding through the introgression of resistance genes (whether of exogenous or endogenous origin) with enhanced expression. It is important to mention that bacteria co-evolve with their hosts. This is the reason why it is desirable to develop crops by stacking genes to confer durable tolerance or resistance against a wide range of phytopathogens. This work focused on analyzing both specific immunity and broad-spectrum genes, with the objective of exploring the potential benefits of combining both immune strategies. To evaluate specific immunity candidate genes were selected based on a transcriptomics-derived experimental approach. Specifically, the ATG1 (Autophagy Related Gene 1) protein family was chosen for evaluation. Two candidate genes from this family are induced during the immune response to P. syringae in Solanum lycopersicum (S. lycopersicum, tomato). The ATG1 family comprises three and five members in S. lycopersicum and Nicotiana benthamiana (N. benthamiana), respectively. As a small protein family, it is suitable for functional characterization via transient gene silencing. Using gene-silenced N. benthamiana plants (a model species), the response of ATG1 dependent on the AvrPto–Pto interaction was studied. This protein interaction, which occurs at high concentrations due to overexpression, amplifies the hypersensitive response (HR), making it visible. It was found that different silencing constructs exhibited delayed HR. Subsequently, N. benthamiana plants overexpressing Pto were infected with P. syringae pv. tabaci (Ps tab), either expressing or not the AvrPto effector, under conditions similar to those in nature. The anticipated acceleration of disease symptoms did not occur (as would be expected for an incompatible pathosystem dependent on the same effector- recognition protein interaction). Moreover, a delay in disease symptoms was observed in this compatible system. To add complexity, bacterial growth was assessed using the same Ps tab infections. Based on the colony-forming unit (CFU) counts in silenced plants, using the same infection conditions as in the disease assay, no differences were observed in the incompatible system compared to the control, consistent with the results of the disease assay. In contrast, in the compatible system, silenced plants showed increased bacterial concentrations. Results also indicated that senescence might be affected. Taken together, these findings strongly support a hypothesis involving a simultaneous autophagy process occurring in parallel, which could reasonably explain the observed results. Regarding broad-spectrum immunity genes, various antimicrobial peptides (AMPs) have been described in the literature. One protein family with AMP-like properties is the SNAKIN/GASA family. This family comprises three subfamilies with multiple members which activity has been demonstrated in various plant species against bacterial, viral, and fungal pathogens. Before this thesis, a phylogenetic tree was constructed using sequences from seven citrus hybrids, with the aim of identifying the SNAKIN/GASA subfamilies reported in the literature. This analysis confirmed the presence of conserved domains and classified the sequences into the three known subfamilies. To complete this analysis, sequences from Solanum tuberosum (S. tuberosum) were included in this thesis, as they have been extensively studied at the institute. A high degree of sequence identity was found, confirming orthologous relationships. In particular, citrus genes GASA6, GASA8 and GASA10 showed similarity to StSN1, StSN2, and StSN3, respectively, each representing one of the three subfamilies. Based on the hypothesis that juvenile, especially reproductive, tissues show greater disease tolerance to ensure fertile offspring, the absolute expression of ten SNAKIN/GASA genes was analyzed in floral, young leaf, and mature leaf tissues from five citrus varieties with varying levels of disease tolerance/resistance, obtained from an experimental station. At least one representative from each subfamily was selected, including the previously mentioned GASA6, GASA8, and GASA10, to perform gene expression analysis in different tissues. Based on these results, these three genes were selected for functional characterization. For this purpose, the genes PtGASA6, PtGASA8 and PtGASA10, derived from Poncirus trifoliata (P. trifoliata), a rootstock variety known for its higher level of disease tolerance, were transiently overexpressed in N. benthamiana. Novel infection systems were developed to allow overexpression and the observation of disease symptoms and HR in N. benthamiana. Two bacteria were used: Ps tab and Xcc, to establish both a compatible and an incompatible pathosystem, respectively, enabling a comprehensive evaluation of immune responses. Additionally, Xcc is the model bacterium used in citrus research. Two of these genes, PtGASA6 and PtGASA10, showed very promising results. After overexpression, both genes delayed disease symptoms and accelerated the HR. This would suggest that increased expression of these genes may help reduce disease progression and induce HR. Notably, PtGASA6 had the strongest effect on advancing HR, while PtGASA10 had the greatest impact on delaying disease symptoms. Since both genes produced encouraging results but affected immunity to different extents, it is plausible their modes of action differ. It would be interesting to investigate their behavior within the plant and whether they can move outside the plant cell, considering that Ca. Liberibacter resides in the vascular system. Based on these results, it can be hypothesized that both genes are promising candidates for introgression into citrus through genomics-assisted breeding or genetic engineering to develop intragenic crops. |l eng | |
| 540 | |2 cc |f https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar | ||
| 653 | 1 | 0 | |a INTERACCION PLANTA PATOGENO |
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