Mecanismos de regulación de la expresión de ZFP36/TTP en células tumorales mamarias
Tristetraprolina (TTP) es una proteína, codificada por el gen ZFP36, que induce la degradación de ARNs mensajeros (ARNm) que contienen secuencias blanco específicas en sus 3'UTRs. Particularmente, ha sido reportado que presenta actividad sobre citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6, LIF, CSF2,...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | , , , , |
| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2025
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| Materias: | |
| Aporte de: | Registro referencial: Solicitar el recurso aquí |
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| 502 | |b Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Química Biológica |c Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |d 2025-07-31 | ||
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| 518 | |o Fecha de publicación en la Biblioteca Digital FCEN-UBA | ||
| 520 | 3 | |a Tristetraprolina (TTP) es una proteína, codificada por el gen ZFP36, que induce la degradación de ARNs mensajeros (ARNm) que contienen secuencias blanco específicas en sus 3'UTRs. Particularmente, ha sido reportado que presenta actividad sobre citoquinas proinflamatorias (TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), sobre ARNm que codifican para oncogenes como c-Myc y Ciclina D, factores angiogénicos como VEGF y proteínas que degradan la matriz extracelular, entre otras. Debido a la regulación negativa que ejerce sobre estos blancos, TTP también actúa como supresor tumoral inhibiendo el crecimiento e invasividad de las células malignas. Resultados propios y de otros grupos muestran que un déficit en la expresión de ZFP36 está asociado a tumores mamarios de peor pronóstico. Asimismo, entre los factores de transcripción que han sido descritos como reguladores de la expresión de TTP en la glándula mamaria se encuentran P-STAT5, NF-κB, AP-1 y LXR, entre otros. Por otro lado, se ha reportado un SNP (single nucleotide polymorphism) localizado en el promotor de ZFP36, que presenta las variantes A, G o T. Ha sido reportado que el genotipo AG ó GG, comparado con el genotipo AA, está asociado a un peor pronóstico para pacientes caucásicas con cáncer de mama en EEUU. Datos provenientes de proyectos genómicos internacionales indican que dicha mutación presenta una frecuencia de alrededor del 50% en la población del continente americano, pero se desconocía este dato para nuestro país. A su vez, está reportado por otros autores que la presencia del polimorfismo afectaría particularmente a secuencias regulatorias que interactúan con factores de transcripción como AP-1, LXR y otros, pero se desconocían los mecanismos moleculares específicos, así como el efecto de posibles reguladores epigenéticos. Basados en estos antecedentes, en este trabajo de Tesis nos propusimos analizar los mecanismos involucrados en la asociación del polimorfismo rs251864 A>G con la prognosis del cáncer de mama luminal. En primer lugar, elaboramos un protocolo experimental que nos permitiera verificar el genotipo del polimorfismo rs251864, en muestras de pacientes y en líneas celulares de cáncer de mama humano. Para ello pusimos a punto una técnica de RFLP a partir de cebadores de diseño propio que permiten la genotipificación de muestras humanas con una efectividad del 100% y de una manera sencilla y económica. En particular, logramos genotipar una cohorte de 20 pacientes de cáncer de mama ER+PR+ provenientes del hospital “Magdalena V de Martinez” de Pacheco en la Provincia de Buenos Aires. Si bien necesitaríamos aumentar el número de muestras analizadas, pudimos constatar que la incidencia del alelo G en dicha cohorte es de aproximadamente un 75%, y que este genotipo se encontró asociado a una menor expresión de TTP medida por inmunohistoquímica (IHQ). A su vez, determinamos el genotipo de dos líneas celulares tumorales de amplio uso en la investigación en cáncer de mama: la línea T-47D, que presenta genotipo G/G y la línea MCF-7 que presenta genotipo A/A, las cuales utilizamos para realizar ensayos in vitro. Determinamos que la línea celular T-47D presenta una expresión basal de TTP significativamente menor que la línea MCF7. En la región proximal al polimorfismo, identificamos sitios de unión para varios factores de transcripción: AP-1, LXR, ER y STAT3, entre otros. Sin embargo, realizando análisis de ChIP-seq, determinamos que STAT3 fosforilado es el factor que se une con mayor probabilidad a nuestra región de interés en el promotor de ZFP36. Ensayos realizados con estímulos con Suero Fetal Bovino (SFB), un inductor rápido de la expresión de ZFP36/TTP, revelaron que la línea celular MCF7 presenta un aumento significativo de la transcripción de dicho gen, mientras que las células T-47D se inducen en un nivel significativamente menor, y a tiempos posteriores. Hipotetizamos que estos efectos podrían estar regulados por mecanismos epigenéticos de represión asociados a la presencia del alelo G, y para comprobarlo realizamos ensayos con 5-Azacitidina (AzaC) un inhibidor de las ADN metiltransferasas (DNMTs). Nuestros resultados indican que el tratamiento con AzaC aumenta la sensibilidad de las células T-47D al estímulo con suero, que presentan una inducción equivalente a la observada en la línea MCF7 sin tratar con AzaC. El análisis de datos bioinformáticos de metilación del ADN en pacientes de cáncer de mama con distintos subtipos, indica que no existe una asociación significativa entre la metilación de la región proximal al polimorfismo y la disminución en la expresión de TTP, pero que esta correlación sí es significativa cuando se considera al promotor de ZFP36/TTP en su conjunto. Estos resultados sugieren que la metilación del ADN es un mecanismo regulatorio relevante de la expresión de TTP en el contexto tumoral mamario. A partir de nuestros experimentos utilizando plásmidos reporteros conteniendo las dos variantes del polimorfismo, pudimos determinar que los factores de transcripción STAT3 fosforilado y AP-1 son los principales efectores de la respuesta a suero. A su vez, observamos que el rol de cada uno es diferente según si está presente la variante A o G del SNP rs251864. Finalmente, realizamos una secuenciación del ARN total (RNA-seq) de un modelo de sub-expresión de TTP previamente puesto a punto en nuestro laboratorio. Los resultados de nuestros análisis indican que la disminución en la expresión de TTP produce un aumento en las vías de señalización vinculadas a la transcripción global del ARN, la represión de la diferenciación celular epitelial, la proliferación celular, la transducción de señales y el remodelado de la matriz extracelular, entre otras características pro-tumorales. Basado en estos resultados proponemos al SNP rs251864 como un biomarcador genético que puede ser efectivo en la toma de decisiones terapéuticas para pacientes con cáncer de mama luminal. |l spa | |
| 520 | 3 | |a Tristetraprolin (TTP) is a protein, encoded by the ZFP36 gene, which induces the degradation of messenger RNAs (mRNAs) containing specific target sequences in their 3'UTRs. Particularly, it has been reported to have activity on proinflammatory cytokines (TNFα, IL-6, LIF, CSF2, IL-10), on mRNAs encoding oncogenes such as c-Myc and Cyclin D, angiogenic factors such as VEGF and proteins that degrade the extracellular matrix, among others. Due to the negative regulation it exerts on these targets, TTP also acts as a tumor suppressor by inhibiting the growth and invasiveness of malignant cells. Our own results and those of other groups show that a deficit in ZFP36 expression is associated with breast tumors of poorer prognosis. Likewise, among the transcription factors that have been described as regulators of TTP expression in the mammary gland are P-STAT5, NF-κB, AP-1 and LXR, among others. On the other hand, a SNP (single nucleotide polymorphism) located in the ZFP36 promoter has been reported, which presents the variants A, G or T. It has been reported that the AG or GG genotype, compared to the AA genotype, is associated with a poorer prognosis for Caucasian patients with breast cancer in the USA. Data from international genomic projects indicate that this mutation has a frequency of around 50% in the population of the American continent, but this data was unknown for our country. In turn, it is reported by other authors that the presence of the polymorphism would particularly affect regulatory sequences that interact with transcription factors such as AP-1, LXR and others, but the specific molecular mechanisms, as well as the effect of possible epigenetic regulators, were unknown. Based on this background, in this Thesis work we set out to analyze the mechanisms involved in the association of the rs251864 A>G polymorphism with the prognosis of luminal breast cancer. First, we developed an experimental protocol that allowed us to verify the genotype of the rs251864 polymorphism in patient samples and in human breast cancer cell lines. To do this, we set up an RFLP technique from our own design primers that allow the genotyping of human samples with 100% effectiveness and in a simple and economical way. In particular, we were able to genotype a cohort of 20 ER+PR+ breast cancer patients from the "Magdalena V de Martinez" hospital in Pacheco in the Province of Buenos Aires. Although we would need to increase the number of samples analyzed, we were able to verify that the incidence of the G allele in this cohort is approximately 75%, and that this genotype was associated with a lower expression of TTP measured by immunohistochemistry (IHC). In turn, we determined the genotype of two tumor cell lines widely used in breast cancer research: the T-47D line, which has a G/G genotype, and the MCF-7 line, which has an A/A genotype, which we used to perform in vitro assays. We determined that the T-47D cell line has a significantly lower basal expression of TTP than the MCF7 line. In the region proximal to the polymorphism, we identified binding sites for various transcription factors: AP-1, LXR, ER and STAT3, among others. However, by performing ChIP-seq analyzes, we determined that phosphorylated STAT3 is the factor that is most likely to bind to our region of interest in the ZFP36 promoter. Assays performed with stimuli with Fetal Bovine Serum (FBS), a rapid inducer of ZFP36/TTP expression, revealed that the MCF7 cell line presents a significant increase in the transcription of said gene, while T-47D cells are induced at a significantly lower level, and at later times. We hypothesize that these effects could be regulated by epigenetic repression mechanisms associated with the presence of the G allele, and to verify this we performed assays with 5-Azacytidine (AzaC), an inhibitor of DNA methyltransferases (DNMTs). Our results indicate that treatment with AzaC increases the sensitivity of T-47D cells to serum stimulus, which show an induction equivalent to that observed in the MCF7 line without AzaC treatment. The analysis of bioinformatic data of DNA methylation in breast cancer patients with different subtypes indicates that there is no significant association between the methylation of the region proximal to the polymorphism and the decrease in TTP expression, but that this correlation is significant when the ZFP36/TTP promoter is considered as a whole. These results suggest that DNA methylation is a relevant regulatory mechanism of TTP expression in the mammary tumor context. From our experiments with reporter plasmids containing the two variants of the polymorphism, we were able to determine that the phosphorylated STAT3 and AP-1 transcription factors are the main effectors of the serum response. In turn, we observed that the role of each one is different depending on whether the A or G variant of the rs251864 SNP is present. Finally, we performed a total RNA sequencing (RNA-seq) of a TTP sub-expression model previously set up in our laboratory. The results of our analyzes indicate that the decrease in TTP expression produces an increase in the signaling pathways linked to global RNA transcription, repression of epithelial cell differentiation, cell proliferation, signal transduction and remodeling of the extracellular matrix, among other pro-tumor characteristics. Based on these results, we propose the rs251864 SNP as a genetic biomarker that can be effective in making therapeutic decisions for patients with luminal breast cancer. |l eng | |
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| 700 | 1 | |a Dansey, María Virginia | |
| 700 | 1 | |a De Luca, Paola | |
| 700 | 1 | |a Carcagno, Abel Luis | |
| 700 | 1 | |a Cánepa, Eduardo Tomás | |
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