Bioprospección de genes antimicrobianos de origen vegetal y desarrollo de herramientas moleculares para el mejoramiento genético Paspalum dilatatum (Poir)
Paspalum dilatatum es una gramínea nativa C4, de alto valor forrajero apreciada por su vigor, persistencia y capacidad de resistir la presión del pastoreo. La principal limitante para su uso como forraje es la baja producción de semillas causada por la infección del hongo fitopatógeno Claviceps pasp...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | , , , , , |
| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2023
|
| Materias: | |
| Aporte de: | Registro referencial: Solicitar el recurso aquí |
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| 246 | 3 | 1 | |a Bioprospection of plant’s antimicrobial genes and development of molecular tools for Paspalum dilatatum’s (Poir) |
| 260 | |c 2023 | ||
| 300 | |a xviii, 203 h. : |b il., fotos color, gráfs. color, tablas | ||
| 502 | |b Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Ciencias Biológicas |c Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales |d 2023-12-21 |g Universidad de Buenos Aires - CONICET. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada (IBBEA) | ||
| 506 | |2 openaire |e Autorización del autor |f info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |g 2026-12-21 | ||
| 518 | |o Fecha de publicación en la Biblioteca Digital FCEN-UBA | ||
| 520 | 3 | |a Paspalum dilatatum es una gramínea nativa C4, de alto valor forrajero apreciada por su vigor, persistencia y capacidad de resistir la presión del pastoreo. La principal limitante para su uso como forraje es la baja producción de semillas causada por la infección del hongo fitopatógeno Claviceps paspali que ataca los tejidos reproductivos reemplazando los ovarios por esclerocios. Esto no solo disminuye el volumen de semillas aptas para el cultivo, sino que, además, trae aparejados riesgos para las especies de pastoreo que consumen las inflorescencias infectadas debido a que los esclerocios se encuentran cargados de toxinas que afectan el sistema nervioso central de bovinos, ovinos y equinos. Hasta el momento no se ha logrado obtener resistencia a C. paspali manteniendo la calidad forrajera de P. dilatatum, por lo tanto, generar estrategias biotecnológicas que permitan controlar la infección, evitando la alteración de otras características de importancia representaría un importante avance para la producción pecuaria de Argentina. La generación de plantas transgénicas de P. dilatatum que expresen péptidos de origen vegetal con actividad antimicrobiana (AMPs) en los estigmas, vía de entrada del patógeno, a partir de promotores específicos de tejido, podría ser una manera eficaz y sustentable de controlar la enfermedad. El objetivo de esta tesis es desarrollar herramientas moleculares que permitan la expresión tejido-específica de AMPs de plantas, en los pistilos de P. dilatatum y otras gramíneas susceptibles a hongos del mismo género. Los objetivos y resultados obtenidos en el presente trabajo se presentan en dos capítulos. El primer capítulo consiste en la identificación, clonado y caracterización de promotores de expresión tejido específicos en tejidos reproductivos, a partir del genoma de Sorghum bicolor, una gramínea cercana evolutivamente a P. dilatatum, cuyo genoma se encuentra secuenciado. Para este estudio, se seleccionaron como candidatos a los promotores que regulan la expresión de las proteínas transferidoras de lípidos (LTPs), conocidas por su amplio rango de expresión. Utilizando modelos ocultos de Markov (HMM) y bases de datos de secuencias de proteínas, se logró identificar un total de 68 genes de LTPs en el genoma de S. bicolor. Estos genes fueron clasificados siguiendo el esquema evolutivo propuesto por Edstam, resultando en 9 genes del tipo 1, 7 del tipo 2, 2 del tipo C, 18 del tipo D, 23 del tipo G, mientras que 9 no pudieron ser clasificados. Además, se llevaron a cabo análisis de patrones de expresión in silico utilizando bases de datos de transcriptomas de S. bicolor, revelando que 21 genes presentan una expresión ubicua, mientras que 34 muestran una expresión específica de tejido. En base a su patrón de expresión se seleccionaron para su clonado y caracterización los promotores de los genes Sb08g002670 y Sb08g002680, denominados PTSb2670 y PTSb2680 respectivamente. Se analizó la presencia de posibles sitios de unión de factores de transcripción conservados en estos promotores, así como en los promotores de genes homólogos de otras gramíneas, también susceptibles a la infección por hongos del género Claviceps. El patrón de expresión y el impacto de los estreses bióticos y abióticos sobre los promotores PTSb2670 y PTSb2680 fue estudiado mediante la sobreexpresión del gen GUS en la planta modelo Arabidopsis thaliana. El promotor PTSb2670 presenta niveles altos de expresión en distintas etapas del desarrollo vegetal y también expresión específica en pistilos, así como una fuerte inducción en respuesta a estreses bióticos y abióticos tanto en plántulas como en plantas adultas; bajo estrés se observa una fuerte inducción en partes aéreas, pero nunca en raíces. El promotor PTSb2680 se expresa exclusivamente en estigma, sin embargo, presenta muy bajos niveles de expresión y no muestra inducción frente a estreses. Es posible concluir que ambos promotores serían de utilidad en la estrategia planteada, teniendo uno de ellos altos niveles de expresión y la capacidad de inducirse frente a estreses bióticos y fitohormonas relacionados a estos, y el otro por su expresión tejido-específica en el foco infectivo. El segundo capítulo incluye la identificación, clonado y caracterización de genes AMPs a partir de los genomas de S. bicolor y Phaseolus vulgaris. Estudios previos del laboratorio identificaron genes codificantes de defensinas y snakinas en el genoma de P. vulgaris. Se seleccionaron aquellos que mostraron inducción de su expresión en el transcriptoma de P. vulgaris en respuesta a infección fúngica. Estos genes candidatos, Phvul.004G019900 (SN58), Phvul.003G197400 (SN29) y Phvul.005G071400 (94D), y otros similares en S. bicolor, Sobic.004G075301 (D12c) y Sobic.004G131400 (D9c), fueron aislados y clonados. Se incluyó como AMP modelo el gen que codifica la snakina tipo 1 de Solanum tuberosum (StSN1), el primer gen de este tipo en ser aislado y caracterizado. Se eligió para la producción de AMPs, mediante expresión transitoria el sistema heterólogo Nicotiana benthamiana. Los AMPs candidatos mostraron niveles de expresión muy bajos, en comparación al modelo StSN1 cuyos niveles de expresión fueron altos, dificultando su detección y producción. Se eligió al AMP SN58 para la optimización del sistema de expresión, logrando un incremento en los niveles de expresión al eliminar los intrones del gen. Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de SN58 contra Pseudomonas syringae pv. syringae, y se observó una acción bacteriostática. Los AMPs identificados y la caracterización de promotores frente a una amplia variedad de estreses representan un aporte de herramientas biotecnológicas versátiles al mejoramiento biotecnológico de plantas. La combinación de promotores tejido-específicos de S. bicolor y AMPs permitirá la obtención de plantas transgénicas de P. dilatatum que expresen los diferentes AMPs en el foco infectivo de C. paspali permitiendo evaluar la eficacia de esta estrategia para la obtención de resistencia a la infección en esta especie y en otras gramíneas susceptibles a Claviceps. A su vez estas estrategias de aplicación sencilla y costo reducido son plausibles de aplicarse no sólo en los modelos seleccionados en esta tesis sino en otras plantas susceptibles a Claviceps. Esto permitirá no solo un control de la infección sino que tendrá un fuerte impacto económico en el área agroganadera. |l spa | |
| 520 | 3 | |a Paspalum dilatatum is a native C4 grass, highly valued for its forage quality due to its vigor, persistence, and ability to withstand grazing pressure. The main limitation to its use as forage is the low seed production caused by the infection from the phytopathogenic fungus Claviceps paspali, which attacks the reproductive tissues, replacing ovaries with sclerotia. This not only reduces the volume of viable seeds for cultivation but also poses risks to grazing species consuming infected inflorescences, as sclerotia are loaded with toxins affecting the central nervous system of cattle, sheep, and horses. Up to this point, achieving resistance to C. paspali while maintaining the forage quality of P. dilatatum has proven to be elusive. Thus, developing biotechnological strategies to control the infection without altering other important traits would represent a significant advancement for Argentina's livestock production. Generating transgenic P. dilatatum plants expressing plant-derived antimicrobial peptides (AMPs) in the stigmas, the pathogen's entry point, using tissue-specific promoters, could be an effective and sustainable approach to disease control. The aim of this thesis is to develop molecular tools enabling tissue-specific expression of plant AMPs in the pistils of P. dilatatum and other grasses susceptible to fungi of the same genus. The objectives and outcomes of this work are presented in two chapters. The first chapter involves the identification, cloning, and characterization of tissue-specific promoters of reproductive tissues, sourced from the genome of Sorghum bicolor, a grass close to P. dilatatum with a sequenced genome. Candidate promoters were selected within the group of lipid transfer protein (LTP) genes, known for their broad expression range. Using hidden Markov models (HMM) and protein sequence databases, a total of 68 LTP genes were identified in the S. bicolor genome and were classified according to the evolutionary scheme proposed by Edstam. In silico analysis of expression patterns using S. bicolor transcriptome databases revealed 21 genes with ubiquitous expression and 34 with tissue-specific expression. Promoters from genes Sb08g002670 and Sb08g002680, designated PTSb2670 and PTSb2680 respectively, were selected for cloning and characterization based on their expression patterns. The presence of potential transcription factor binding sites in these promoters was examined, along with the promoters of homologous genes in other grasses susceptible to Claviceps infection. The expression pattern and impact of biotic and abiotic stresses on PTSb2670 and PTSb2680 promoters were studied through overexpression of the GUS gene in the model plant Arabidopsis thaliana. PTSb2670 demonstrated high expression levels at various stages of vegetative development, specific expression in pistils, and strong induction in response to both biotic and abiotic stresses in both seedlings and mature plants. Under stress, a pronounced induction was observed in aerial parts but not in roots. On the other hand, promoter PTSb2680 exhibited exclusive expression in stigmas, albeit with very low expression levels and no induction in response to stresses. It can be concluded that both promoters could be useful in the proposed strategy, with one displaying high expression levels and inducibility in response to biotic stresses and related phytohormones, and the other showcasing tissue-specific expression in the infectious focus. The second chapter encompasses the identification, cloning, and characterization of AMP genes from the genomes of S. bicolor and Phaseolus vulgaris. Previous studies identified genes encoding defensins and snakins in the P. vulgaris genome, selecting those showing expression induction in response to fungal infection in P. vulgaris transcriptome. These candidate genes, Phvul.004G019900 (SN58), Phvul.003G197400 (SN29), and Phvul.005G071400 (94D), along with similar ones in S. bicolor, Sobic.004G075301 (D12c) and Sobic.004G131400 (D9c), were isolated and cloned. The gene encoding the type 1 Snakin from Solanum tuberosum (StSN1) was included as a model AMP. For AMP production, transient expression in the heterologous system Nicotiana benthamiana was chosen. The candidate AMPs exhibited very low expression levels, compared to the high expression levels of the StSN1 model, posing challenges in their detection and production. AMP SN58 was selected for expression system optimization, resulting in increased expression levels upon intron removal. In vitro antimicrobial activity of SN58 against Pseudomonas syringae pv. syringae was evaluated, demonstrating bacteriostatic action. The identified AMPs and the characterization of promoters under a wide array of stresses contribute versatile biotechnological tools to plant improvement. The combination of tissue-specific promoters from S. bicolor and AMPs will enable the creation of transgenic P. dilatatum plants expressing different AMPs at the infectious focus of C. paspali, allowing the assessment of this strategy's effectiveness in conferring resistance to infection in this species and other grasses susceptible to Claviceps. |l eng | |
| 540 | |2 cc |f https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar | ||
| 653 | 1 | 0 | |a PROMOTOR TEJIDO ESPECIFICO |
| 653 | 1 | 0 | |a PEPTIDOS ANTIMICROBIANOS |
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| 700 | 1 | |a Zelada, Alicia Mercedes | |
| 700 | 1 | |a Schrauf, Gustavo Enrique | |
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| 700 | 1 | |a Marconi, Patricia Laura | |
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| 700 | 1 | |a Silvani, Vanesa Analía | |
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