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Titulos:
Estudios sobre la estructura de la molécula del intercambiador Na+/Ca2+ durante la interacción con ligandos regulares / Claudia Daniela Centanni
Lugar de Edición:
Córdoba :
Editor:
[s.n.],
Fecha de Edición:
2011.
Nota de contenido:
ResumenEl intercambiador Na+¡Ca2+ presente en la membrana plasmática de lamayoría de las células animales puede introducir o eliminar Ca2+ en intercambiopor Na ", Debido a su alta capacidad de transporte es el principal mecanismo deeflujo de Ca2+ durante la activación celular por lo que es de vital importancia parala función y sobrevida celular. Es un sistema complejo, electrogénico y asimétricoque requiere de la competición por sus sitios de transporte y es regulado porligandos iónicos intra y extracelulares, además de moduladores metabólicos comoMg-A TP y los fosfoinosítidos del micro-entorno lipídico que rodea a la proteínatransportadora.El presente trabajo de tesis doctoral se realizó con el objeto de poder aislar,por medio del clonado y expresión recombinate en Escherichia coli (E. coli), laporción citoplasmática del intercambiador a fin de comprender en profundidad deque -nanera, los ligandos reguladores modifican la estructura del asa al unirse a lamisma para poder ver sólo los efectos de los ligandos sobre la estructura de lamolécula sin tener interferencia del transporte de los mismos, ya que el sitio detransporte no se encuentra contenido en la secuencia de la proteína recombinante10expresada. Utilizando distintos vectores de expresión en bacterias se realizaronnumerosas construcciones, tanto del asa citoplasmática truncada delintercambiador Na+/Ca2+ cardíaco como así también del asa citoplasmáticacompleta del intercambiador Na+/Ca2+ de calamar para poder purificar la proteínay evaluar el comportamiento de la misma frente a sus ligandos reguladores comoson Ca2+, W, Na+, a través de sus cambios de conformación.Para esto se realizaron experimentos como la unión de 45Ca, catiónradio activo, la marcación con sondas fluorescentes como la FITC, y estudioscomparativos de los cambios estructurales en la región reguladora citoplasmáticadel intercambiador Na+/Ca2+ de calamar NCXSQl y del intercambiador Na+/Ca2+cardíaco NCXl como consecuencia de su interacción con ligandos reguladores.Los efectos observados consistieron en cuantificar los cambios en la migración engeles de poliacrilamida del asa reguladora de NCXSQ 1 incubada a diferentesconcentraciones de Ca2+ examinando el efecto de pH y Na+, los dos inhibidoresiónicos intracelulares del intercambio Na+/Ca2+. Los resultados obtenidos puedenresumirse de la siguiente manera:Se consiguió clonar, expresar y purificar el asa truncada citoplasmática delintercambiador Na+/Ca2+ cardíaco, el asa citoplasmática completa delintercambiador Na+/ Ca2+ de calamar en E coli, lográndose la purificación deambas proteínas cantidades considerables para poder realizar los estudiosfuncionales con sus ligandos reguladores.Se logró evidenciar el efecto de ci+, H+, Na + sobre el asa citoplasmáticadel intercambiador, pudiendo se observar el mismo mediante los cambiosconformacionales que presentaba la proteina incubada presencia de estos11ligandos. La interacción se evidenció también por la diferencia en la accesibilidadde sondas fluorescentes como fluoresceína reflejada por un cambio mesurable enla cantidad de proteína marcada cuando la proteína se incubaba a diferentesconcentraciones de Ca2+, evideciando un cambio en la conformación de la proteínaal ligar Ca2+.Por lo expuesto anteriormente en este trabajo se ha logrado por primeravez obtener el clonado y la expresión heteróloga del asa citoplasmática, lugardonde residen los sitios reguatorios del intercambiador Na+/Ca2+, y demostrar queNa +, y Ir tendrían un sitio regulatorio incluído en esta región de la proteína, hechono demostrado aún, a diferencia de lo que sucede con el sitio de union de Ca2+, elcual ya ha sido totalmente descripto.La importancia original del presente trabajo radica en que conociendo queNa + y H+ actuan en el asa citoplasmática, a futuro se podrán caracterizar ylocalizar de manera precisa los dominios de unión de ambos ligandos, reguladoresimportantes para la función del intercambiador. En virtud de que los resultadospresentados están de acuerdo con los publicados para este transportador en elsistema de axón gigante de calamar sujeto a diálisis y, que como mencionaramosen los experimentos descriptos, en las proteinas estudiadas no existen los sitios detransporte, los datos apoyan el modelo cinético propuesto anteriormente porBeauge y Dipolo, el cual postula los sitios inhibitorio s de Ir- y Na + en el asareguladora. Los experimentos con el asa reguladora del intercambiador cardíaco(NCXl) serán fundamentales para establecer si el modelo de calamar es soloválido para esa preparación o es general.
Palabras clave:
Membrana celular; Biofísica; Canales iónicos
Leader:
nam
Campo 003:
AR-CdUAS
Campo 008:
100630s2011 ag_||||| |||| 001 0 spa d
Campo 040:
^aAR-CdUAS^cAR-CdUAS
Campo 100:
^98987^aCentanni, Claudia Daniela
Campo 245:
10^aEstudios sobre la estructura de la molécula del intercambiador Na+/Ca2+ durante la interacción con ligandos regulares / ^cClaudia Daniela Centanni
Campo 246:
Campo 260:
^aCórdoba : ^b[s.n.], ^c2011.
Campo 300:
^a137 p. ; ^c30 cm.
Campo 520:
^aResumenEl intercambiador Na+¡Ca2+ presente en la membrana plasmática de lamayoría de las células animales puede introducir o eliminar Ca2+ en intercambiopor Na ", Debido a su alta capacidad de transporte es el principal mecanismo deeflujo de Ca2+ durante la activación celular por lo que es de vital importancia parala función y sobrevida celular. Es un sistema complejo, electrogénico y asimétricoque requiere de la competición por sus sitios de transporte y es regulado porligandos iónicos intra y extracelulares, además de moduladores metabólicos comoMg-A TP y los fosfoinosítidos del micro-entorno lipídico que rodea a la proteínatransportadora.El presente trabajo de tesis doctoral se realizó con el objeto de poder aislar,por medio del clonado y expresión recombinate en Escherichia coli (E. coli), laporción citoplasmática del intercambiador a fin de comprender en profundidad deque -nanera, los ligandos reguladores modifican la estructura del asa al unirse a lamisma para poder ver sólo los efectos de los ligandos sobre la estructura de lamolécula sin tener interferencia del transporte de los mismos, ya que el sitio detransporte no se encuentra contenido en la secuencia de la proteína recombinante10expresada. Utilizando distintos vectores de expresión en bacterias se realizaronnumerosas construcciones, tanto del asa citoplasmática truncada delintercambiador Na+/Ca2+ cardíaco como así también del asa citoplasmáticacompleta del intercambiador Na+/Ca2+ de calamar para poder purificar la proteínay evaluar el comportamiento de la misma frente a sus ligandos reguladores comoson Ca2+, W, Na+, a través de sus cambios de conformación.Para esto se realizaron experimentos como la unión de 45Ca, catiónradio activo, la marcación con sondas fluorescentes como la FITC, y estudioscomparativos de los cambios estructurales en la región reguladora citoplasmáticadel intercambiador Na+/Ca2+ de calamar NCXSQl y del intercambiador Na+/Ca2+cardíaco NCXl como consecuencia de su interacción con ligandos reguladores.Los efectos observados consistieron en cuantificar los cambios en la migración engeles de poliacrilamida del asa reguladora de NCXSQ 1 incubada a diferentesconcentraciones de Ca2+ examinando el efecto de pH y Na+, los dos inhibidoresiónicos intracelulares del intercambio Na+/Ca2+. Los resultados obtenidos puedenresumirse de la siguiente manera:Se consiguió clonar, expresar y purificar el asa truncada citoplasmática delintercambiador Na+/Ca2+ cardíaco, el asa citoplasmática completa delintercambiador Na+/ Ca2+ de calamar en E coli, lográndose la purificación deambas proteínas cantidades considerables para poder realizar los estudiosfuncionales con sus ligandos reguladores.Se logró evidenciar el efecto de ci+, H+, Na + sobre el asa citoplasmáticadel intercambiador, pudiendo se observar el mismo mediante los cambiosconformacionales que presentaba la proteina incubada presencia de estos11ligandos. La interacción se evidenció también por la diferencia en la accesibilidadde sondas fluorescentes como fluoresceína reflejada por un cambio mesurable enla cantidad de proteína marcada cuando la proteína se incubaba a diferentesconcentraciones de Ca2+, evideciando un cambio en la conformación de la proteínaal ligar Ca2+.Por lo expuesto anteriormente en este trabajo se ha logrado por primeravez obtener el clonado y la expresión heteróloga del asa citoplasmática, lugardonde residen los sitios reguatorios del intercambiador Na+/Ca2+, y demostrar queNa +, y Ir tendrían un sitio regulatorio incluído en esta región de la proteína, hechono demostrado aún, a diferencia de lo que sucede con el sitio de union de Ca2+, elcual ya ha sido totalmente descripto.La importancia original del presente trabajo radica en que conociendo queNa + y H+ actuan en el asa citoplasmática, a futuro se podrán caracterizar ylocalizar de manera precisa los dominios de unión de ambos ligandos, reguladoresimportantes para la función del intercambiador. En virtud de que los resultadospresentados están de acuerdo con los publicados para este transportador en elsistema de axón gigante de calamar sujeto a diálisis y, que como mencionaramosen los experimentos descriptos, en las proteinas estudiadas no existen los sitios detransporte, los datos apoyan el modelo cinético propuesto anteriormente porBeauge y Dipolo, el cual postula los sitios inhibitorio s de Ir- y Na + en el asareguladora. Los experimentos con el asa reguladora del intercambiador cardíaco(NCXl) serán fundamentales para establecer si el modelo de calamar es soloválido para esa preparación o es general.
Campo 650:
4^9469^aMembrana celular
Campo 650:
4^981^aBiofísica
Campo 650:
4^98790^aCanales iónicos
Campo 700:
1 ^98988^aBeaugé, Luis Alberto^eths
Campo 700:
1 ^aArgüello, Gerardo Aníbal^bUniversidad Nacional de Córdoba.^cFacultad de Ciencias Químicas.^cDepartamento de Fisicoquímica.^cConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas.^cInstituto de Investigaciones en Físico-Química de Córdoba.^ecths^92114
Campo 700:
1 ^aCabanillas, Ana María de Los Angeles^cUniversidad Nacional de Córdoba. ^cFacultad de Ciencias Químicas. ^cDepartamento de Bioquímica Clínica. ^cConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. ^cCentro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología.^81958-2017^ecths^92814
Campo 700:
1 ^aFidelio, Gerardo Daniel^cUniversidad Nacional de Córdoba. ^cFacultad de Ciencias Químicas. ^cDepartamento de Química Biológica. ^cConsejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. ^cCentro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba.^ecths^93859
Campo 700:
1 ^98885^aGonzález Flecha, Luis Federico^eevl
Proveniencia:
^aUniversidad Nacional de Córdoba - Facultad de Ciencias Químicas - Biblioteca
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Institucion:
Universidad Nacional de Córdoba
Dependencia:
Facultad de Ciencias Químicas

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