Endocitosis dependiente e independiente de dinamina asociadas a la exocitosis de pool vesículas inmediatamente liberable en células cromafines de la médula adrenal
EI IRP (por Immediately Releasable Pool), es un grupo de vesículas secretorias cuya exocitosis está altamente acoplada al estímulo debido a su estrecha asociación con canales de Ca²+ voltaje dependientes (CCVD). Sabemos por resultados previos, que entre un 40 y un 50% de IRP es exocitado por la apli...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Marz
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7152_Bayones |
| Aporte de: |
| Sumario: | EI IRP (por Immediately Releasable Pool), es un grupo de vesículas secretorias cuya exocitosis está altamente acoplada al estímulo debido a su estrecha asociación con canales de Ca²+ voltaje dependientes (CCVD). Sabemos por resultados previos, que entre un 40 y un 50% de IRP es exocitado por la aplicación de un potencial de acción (PAs), y que dicha exocitosis es seguida por una endocitosis rápida dinamina-dependiente totalmente compensatoria, ligada a un proceso rápido de recuperación de este pool vesicular. Por otro lado, la exocitosis completa de IRP (inducida por un pulso cuadrado de voltaje de 50 ms), es seguida también por un proceso endocítico que solamente compensa un 50% de la exocitosis previa, pero no sabemos nada acerca del mecanismo subyacente. En una primera parte de este trabajo de tesis nos propusimos estudiar la participación de la GTPasa dinamina en la endocitosis, al liberar gradualmente IRP en células cromafines murinas. Para ello, estimulamos con un protocolo compuesto por pulsos despolarizantes de duración creciente: PAS (5 ms) y pulsos cuadrados (SQPS) de 5, 10, 25, y 50 ms (SQP5-50ms). Nuestros resultados mostraron que si bien la dinamina es esencial en la endocitosis evocada por PAs, a medida que la fracción exocitada aumenta, este proceso se vuelve insensible a diferentes inhibidores de la actividad de esta proteína. Esto indica que al liberar completamente IRP se activa un proceso endocítico dinamina-independiente. Observamos, además, que la velocidad de esta endocitosis independiente de dinamina se correlaciona con la entrada de Ca²+, estimada como la integral debajo de la curva de corriente de Ca2+. Por otro lado, la aplicación de distintos inhibidores de la proteína quinasa C (PKC) disminuyeron la magnitud y la velocidad de la endocitosis dinamina-independiente, y el tratamiento con PMA (un activador de PKC) aumentó significativamente la amplitud de este proceso endocítico. Por lo tanto concluimos que dicha endocitosis dinamina-independiente es un proceso Ca2+ dependiente regulado por PKC. En la segunda parte de la Tesis, evaluamos el efecto de dos mutaciones de la dinamina-2, A618T y S619L, relacionadas con el desarrollo de la miopatía centronuclear, cuyos efectos sobre la exocitosis y endocitosis en células cromafines son desconocidos. La expresión de estas mutantes no modificó la exocitosis de IRP para ninguno de los estímulos evaluados. Sin embargo, inhibió significativamente a la endocitosis evocada por PAs, sin afectar a aquella provocada por SQP50ms, lo cual es coherente con la predominancia de la endocitosis dinamino-dependiente en el primer tipo de estímulo. Finalmente, estímulos más potentes, que exocitan cantidades de vesículas marcadamente mayores que IRP, promueven una endocitosis lenta identificada previamente por otros autores como un mecanismo clatrina dependiente, que es a su vez dependiente de dinamina. Coherentemente, este proceso resultó muy sensible a ambas mutantes. Por otro lado, la exocitosis de cantidades grandes de vesículas, inducida por pulsos despolarizantes prolongados o la aplicación del agonista nicotínico DMPP por 10 s, resultó inhibida significativamente en presencia de A618T y S619L. Este resultado, sumado a la falta de efecto que se observó previamente para estímulos de corta duración, sugiere que estas mutantes podrían estar alterando la provisión de vesículas a la membrana. De hecho, al analizar la distribución de vesículas secretorias por medio de microscopía confocal, observamos que la recuperación de las vesículas en las proximidades de la membrana plasmática, luego de un estímulo que induce exocitosis, se vio afectada negativamente en presencia de A618T y S619L. Llamativamente, se observó una marcada disminución en la formación de novo de F-actina cortical en células expresando las mutaciones, pero no en la condición control. Es esperable que esta disrupción en la formación de F-actina cortical tenga un efecto directo en el tráfico de vesículas a la membrana y, por lo tanto, en la recuperación de la población vesicular liberable y en la exocitosis inducida por estímulos potentes. Por otro lado, está demostrado que la F-actina participa en prácticamente todos los mecanismos de endocitosis conocidos. Por lo tanto, la alteración de la dinámica del citoesqueleto de F-actina cortical puede ser un denominador común a todos los efectos causados por A618T y S619L. Sin embargo, el mecanismo por el cual A618T y S619L producen este efecto sobre la F-actina, aun es una interrogante que queda por ser elucidada. |
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