Sondas luminiscentes para microscopía. Modulación de sus propiedades ópticas y marcación específica de biomoléculas
Esta Tesis comprende dos objetivos fundamentales: uno es el desarrollo de sondas fluorescentes para marcación específica de proteínas y el segundo es el control de las propiedades ópticas de nanopartículas luminiscentes para lograr la detección específica de biomoléculas de interés y su seguimiento...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2007
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4059_Spagnuolo |
| Aporte de: |
| Sumario: | Esta Tesis comprende dos objetivos fundamentales: uno es el desarrollo de sondas fluorescentes para marcación específica de proteínas y el segundo es el control de las propiedades ópticas de nanopartículas luminiscentes para lograr la detección específica de biomoléculas de interés y su seguimiento en el tiempo por microscopía de fluorescencia. El desarrollo de sondas para marcación específica se llevó adelante por dos estrategias: una involucró compuestos biarsenicados y la segunda la síntesis de compuestos con grupos tioéster. Se prepararon dos nuevas sondas de la familia de los fluoresceinditioarseniatos (FlAsH), con propiedades espectroscópicas mejoradas en comparación con las previamente descriptas, destinadas a su aplicación en la metodología sonda biarsenicada-motivo tetracisteína. Como parte del diseño de estas sondas, se estudió la fotoquímica de los fluoróforos precursores con espectrometría UV-vis y fotólisis de destello. Se realizó una completa caracterización espectroscópica de los complejos sonda-péptido así como también se estudió la cinética de la reacción de marcación in vitro en un sistema modelo y se analizó la fotoestabilidad del mismo. Por otra parte, se estudió la eficiencia de estos compuestos como donantes del proceso de transferencia de energía con aceptores fotocrómicos (pcFRET) y se evaluó la marcación específica en distintos sistemas in vivo, a través de técnicas de microscopía de fluorescencia en estado estacionario y con resolución temporal (FLIM). Se obtuvieron también distintas sondas derivadas de tioésteres para su aplicación en la metodología de marcación que utiliza la reacción de unión química nativa (NCLR, native chemical ligation reaction). Se estudió la viabilidad de la marcación in vitro por esta técnica utilizando un péptido modelo. La aplicación de estos compuestos en un sistema in vivo permitió evaluar esta estrategia de marcación específica por primera vez en células eucariotas vivas. Por último, se trabajó en el control de las propiedades ópticas de las nanopartículas fluorescentes Quantum dots, con la metodología de pcFRET. Se obtuvieron resultados exitosos en los experimentos por espectroscopía así como también, por microscopía. |
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