Estudios moleculares de sialidasas de Trypanosomátidos : relación estructura/función
La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugadoa sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimát...
Guardado en:
| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis Doctoral |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
1999
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3145_Buschiazzo |
| Aporte de: |
| Sumario: | La trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi es una enzima cuya existencia fue postulada en 1985cuando se probó que este parásito intracelular de células de mamífero, posee ácido siálico conjugadoa sus propias moléculas de superficie. La trans-sialidasa fue posteriormente purificada, caracterizadaenzimáticamente y su gen clonado. Así se demostró en primer lugar, que era una actividad novedosacomo transglicosidasa, ya que no utiliza como sustrato un dador nucleótido-azúcar, que en todas lasotras sialiltransferasas cucarióticas conocidas, es el CMP-siálico. En segundo lugar, el análisis desecuencia reveló una lejana pero evidente homología con varias sialidasas bacterianas, y no con lassialiltransferasas eucariotas. En los últimos años han surgido distintos tipos de evidenciasexperimentales, que involucran a la trans-sialidasa en los mecanismos de adhesión/invasión de T.cruzi a las células del mamífero huésped, en el escape temprano de parásitos invasivos de la vacuolaparasitófora de la célula hospedadora y en la evasión del camino alternativo de fijación delcomplemento. La actividad de trans-sialidasa, ha sido detectada hasta el momento sólo en T. cruzi y en dos parásitostripanosomátidos emparentados, T. brucei y Endotrypanum sp. En algunos otros tripanosomátidosse han encontrado sialidasas, pero sin actividad de transferasa detectable, como en el caso de T.rangeli. Hasta ahora no se sabía si la sialidasa de este parásito no patogénico, estaba relacionadacon la trans-sialidasa. Con el objetivo de comprender el(los) mecanismo(s) en el(los) que la trans-sialidasa está involucrada,en relación a la interacción huésped/parásito, en este trabajo de Tesis se ha avanzado en distintosaspectos del estudio molecular de la trans-sialidasa de T. cruzi y la sialidasa de T. rangeli: 1. Se optimizaron los sistemas de expresión y purificación de la trans-sialidasa recombinante con elfin de obtener grandes cantidades de proteína >95% pura. 2. Se utilizó trans-sialidasa recombinante pura como material inicial para cristalizar y comenzarestudios cristalográficos por difracción de rayos X, tendientes a resolver la estructuratridimensional de la misma. Además de las variaciones convencionales en los métodos ycondiciones de cristalización, y mientras no se obtengan cristales adecuados, se procedió abuscar la separación de dominios parciales de la proteina para cristalizar de formaindependiente. 3. En paralelo con los puntos anteriores, se demostró que la sialidasa de T rangelí es homóloga a latrans-sialidasa dc T. cruzi. Para ello se purificó la sialidasa nativa a partir de sobrenadantesde cultivo de T. rangeli, se microsecuenció y se logró clonar trece genes homólogos, miembrosde lo que hemos denominado la familia multigénica de la sialidasa de T. rangeli. 4. Tres de los genes clonados codifican proteínas recombinantes con actividad de sialidasa comparablea la de la enzima nativa cuando se expresan en Escherichia coli. Uno de ellos fue secuenciadocompletamente, revelando una identidad en aminoácidos de 68.9% cuando se lo comparacon la trans-sialidasa de T. cruzi, aumentando a una similitud dc 86.7% si se admitensustituciones conservativas. 5. Se cristalizó la enzima nativa de T.rangeli sola y ligada a un inhibidor competitivo. Se resolviósu estructura tridimensional a partir del patrón de difracción de rayos X, hasta una resoluciónde 2.2Å. En paralelo se resolvió la estructura tridimensional de la misma proteína acomplejadaal inhibidor hasta 2.9Å. 6. Se modelizó la estructura tridimensional de la trans-sialidasa, tomando como referencia iniciallas coordenadas atómicas de la sialidasa, dada la gran homología entre las dos proteínas. 7. Se construyeron y expresaron moléculas quiméricas entre ambas enzimas con el objetivo deavanzar en la definición de regiones y/o residuos claves en la transglicosilación. |
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