Regulación transcripcional y post-transcripcional de la subunidad Tpk1 de PKA de Saccharomyces cerevisiae por estrés térmico

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Existen varios niveles de control que interactúan en forma dinámica y coordinada para mantener la especificidad de la señalización: la secuencia blanco alrededor del sitio de fosforilación, la presencia o ausencia de proteínas que permiten el anclaje de la quinasa a través de la subunidad regulatori...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Cañonero, Luciana
Otros Autores:	Rossi, Silvia Graciela
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2022
Materias:	PKA TPK1 mRNA SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRANSDUCCION DE SEÑALES ESPECIFICIDAD Tpk1 SIGNAL TRANSDUCTION SPECIFICITY
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7077_Canonero
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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description	Existen varios niveles de control que interactúan en forma dinámica y coordinada para mantener la especificidad de la señalización: la secuencia blanco alrededor del sitio de fosforilación, la presencia o ausencia de proteínas que permiten el anclaje de la quinasa a través de la subunidad regulatoria y que regulan de esta manera la interacción quinasa–sustrato, la localización subcelular diferencial de las subunidades catalíticas frente a distintos estímulos y los niveles de expresión del sustrato y la quinasa. La PKA de S.cerevisiae es una holoenzima compuesta por un dímero de subunidad regulatoria, Bcy1, y dos subunidades catalíticas, Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Las distintas subunidades se expresan diferencialmente en condiciones como el estrés térmico y salino o disponibilidad y tipo de fuente de carbono. La regulación de la expresión de cada subunidad de la holoenzima es uno de los niveles de control que determinan la especificidad de la respuesta cAMP-PKA. El objetivo general de este trabajo fue contribuir a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la especificidad en la vía de señalización de cAMP-PKA en S.cerevisiae. En esta tesis estudiamos el mecanismo a través del cual la vía cAMP-PKA media su respuesta especifica al estrés térmico y a la adaptación térmica en la levadura. Demostramos que frente al estrés térmico a 37°C se inducen los niveles del mRNA de TPK1. Este incremento resulta de un aumento tanto en la actividad del promotor de TPK1 como de la vida media del transcripto. Sin embargo, no se detecta ningún cambio en los niveles de proteína Tpk1. Durante el estrés térmico el mRNA de TPK1 se ensambla en gránulos citoplasmáticos. Los gránulos resultan resistentes al tratamiento con cicloheximida y en un perfil de polisomas el transcripto de TPK1 se encuentra en mayor proporción en las fracciones que contienen monosomas o RNA libre, indicando que su traducción se encuentra inhibida. La regulación de la expresión de TPK1 se evaluó también durante condiciones de estrés térmico que promueven la termotolerancia. Una levadura que se expone de manera abrupta a un estrés térmico responderá de una forma menos eficiente que si, antes de exponerla a la temperatura elevada, se la somete por un período corto de tiempo a una temperatura no letal por encima de la óptima. En este caso la levadura adquiere una mayor capacidad de sobrevivir al estrés térmico. Este fenómeno se conoce como inducción de termotolerancia. En estas condiciones, realizando dos incubaciones a 37°C separadas por períodos de recuperación a 25°C, se observó que los gránulos que contienen mRNA de TPK1 son dinámicos, ensamblándose y desarmándose durante los cambios de temperatura. Mientras los niveles de mRNA aumentan en los períodos de incubación a 37°C, los niveles de proteína Tpk1 están significativamente aumentados en el periodo final de recuperación a 25°C. Entre los caminos que se activan en respuesta al estrés térmico en S. cerevisiae, se encuentra la vía CWI (Integridad de la pared celular). Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la expresión de TPK1, se analizó el entrecruzamiento entre las vías CWI y cAMP-PKA. Demostramos que el sensor Wsc3 es necesario para la regulación de la expresión de TPK1 durante el estrés térmico. De la cascada MAPK, que forma parte de la vía CWI y rio abajo del sensor, sólo la quinasa Mkk1 y el factor de transcripción Swi4 poseen un rol en la expresión de TPK1, en respuesta a este tipo de estrés. El ensamblado de los focos en el estrés térmico depende del sensor Wsc3. La expresión de proteína Tpk1 durante la termotolerancia es menor en una cepa mutante wsc3Δ que en la cepa WT. Se correlacionaron los cambios de expresión con la actividad PKA in vivo y consecuentemente al aumento de Tpk1 en la termotolerancia, se determinó que la actividad PKA en las células mutantes wsc3Δ resulta más baja. Todos estos resultados evidencian la participación de la vía CWI en la expresión de TPK1 durante el estrés térmico y aportan un antecedente más al entrecruzamiento de la vía CWI y PKA. Finalmente, realizamos experimentos para demostrar que la regulación de la expresión de la subunidad TPK1 en respuesta al estrés térmico, redunda en un cambio en la proporción de las isoformas que conforman la holoenzima. Demostramos que la cantidad de la isoforma Tpk1 en la holoenzima es significantemente mayor durante el segundo período de recuperación a 25°C, comparando con cualquiera de las otras condiciones testeadas. Los resultados en su conjunto indican la existencia de un mecanismo que regula la expresión de la subunidad Tpk1 frente a un determinado estímulo como es el estrés térmico. El incremento en la actividad de PKA dependiente de Tpk1 durante la adaptación celular al estrés por calor podría contribuir a la aptitud celular general cuando se restablecen condiciones ambientales más favorables. Los resultados indican la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de TPK1 que permite ajustar la especificidad de cAMP-PKA para que la célula logre la mejor respuesta a un determinado estímulo.
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La PKA de S.cerevisiae es una holoenzima compuesta por un dímero de subunidad regulatoria, Bcy1, y dos subunidades catalíticas, Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Las distintas subunidades se expresan diferencialmente en condiciones como el estrés térmico y salino o disponibilidad y tipo de fuente de carbono. La regulación de la expresión de cada subunidad de la holoenzima es uno de los niveles de control que determinan la especificidad de la respuesta cAMP-PKA. El objetivo general de este trabajo fue contribuir a dilucidar los mecanismos moleculares que controlan la especificidad en la vía de señalización de cAMP-PKA en S.cerevisiae. En esta tesis estudiamos el mecanismo a través del cual la vía cAMP-PKA media su respuesta especifica al estrés térmico y a la adaptación térmica en la levadura. Demostramos que frente al estrés térmico a 37°C se inducen los niveles del mRNA de TPK1. Este incremento resulta de un aumento tanto en la actividad del promotor de TPK1 como de la vida media del transcripto. Sin embargo, no se detecta ningún cambio en los niveles de proteína Tpk1. Durante el estrés térmico el mRNA de TPK1 se ensambla en gránulos citoplasmáticos. Los gránulos resultan resistentes al tratamiento con cicloheximida y en un perfil de polisomas el transcripto de TPK1 se encuentra en mayor proporción en las fracciones que contienen monosomas o RNA libre, indicando que su traducción se encuentra inhibida. La regulación de la expresión de TPK1 se evaluó también durante condiciones de estrés térmico que promueven la termotolerancia. Una levadura que se expone de manera abrupta a un estrés térmico responderá de una forma menos eficiente que si, antes de exponerla a la temperatura elevada, se la somete por un período corto de tiempo a una temperatura no letal por encima de la óptima. En este caso la levadura adquiere una mayor capacidad de sobrevivir al estrés térmico. Este fenómeno se conoce como inducción de termotolerancia. En estas condiciones, realizando dos incubaciones a 37°C separadas por períodos de recuperación a 25°C, se observó que los gránulos que contienen mRNA de TPK1 son dinámicos, ensamblándose y desarmándose durante los cambios de temperatura. Mientras los niveles de mRNA aumentan en los períodos de incubación a 37°C, los niveles de proteína Tpk1 están significativamente aumentados en el periodo final de recuperación a 25°C. Entre los caminos que se activan en respuesta al estrés térmico en S. cerevisiae, se encuentra la vía CWI (Integridad de la pared celular). Para profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la expresión de TPK1, se analizó el entrecruzamiento entre las vías CWI y cAMP-PKA. Demostramos que el sensor Wsc3 es necesario para la regulación de la expresión de TPK1 durante el estrés térmico. De la cascada MAPK, que forma parte de la vía CWI y rio abajo del sensor, sólo la quinasa Mkk1 y el factor de transcripción Swi4 poseen un rol en la expresión de TPK1, en respuesta a este tipo de estrés. El ensamblado de los focos en el estrés térmico depende del sensor Wsc3. La expresión de proteína Tpk1 durante la termotolerancia es menor en una cepa mutante wsc3Δ que en la cepa WT. Se correlacionaron los cambios de expresión con la actividad PKA in vivo y consecuentemente al aumento de Tpk1 en la termotolerancia, se determinó que la actividad PKA en las células mutantes wsc3Δ resulta más baja. Todos estos resultados evidencian la participación de la vía CWI en la expresión de TPK1 durante el estrés térmico y aportan un antecedente más al entrecruzamiento de la vía CWI y PKA. Finalmente, realizamos experimentos para demostrar que la regulación de la expresión de la subunidad TPK1 en respuesta al estrés térmico, redunda en un cambio en la proporción de las isoformas que conforman la holoenzima. Demostramos que la cantidad de la isoforma Tpk1 en la holoenzima es significantemente mayor durante el segundo período de recuperación a 25°C, comparando con cualquiera de las otras condiciones testeadas. Los resultados en su conjunto indican la existencia de un mecanismo que regula la expresión de la subunidad Tpk1 frente a un determinado estímulo como es el estrés térmico. El incremento en la actividad de PKA dependiente de Tpk1 durante la adaptación celular al estrés por calor podría contribuir a la aptitud celular general cuando se restablecen condiciones ambientales más favorables. Los resultados indican la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de TPK1 que permite ajustar la especificidad de cAMP-PKA para que la célula logre la mejor respuesta a un determinado estímulo. Cells have developed complex signaling pathways that let them respond to different environmental stimuli. These signal transduction pathways allow the cell to monitor external environment and the internal state to mount the appropriate physiological responses. One of the most important signaling circuits in Saccharomyces cerevisiae is the cAMP-PKA (protein kinase A) pathway. In this yeast, extracellular glucose and a variety of signals related to growth and stress conditions regulate intracellular cAMP levels. cAMP modulates the activity of PKA, which by phosphorylation of target substrates, regulates a wide variety of cellular processes. The outcome of cAMP-PKA signaling requires tight control of responses specificity. There are several control levels that interact in a dynamic and coordinated way to maintain the specificity of the signaling: the target sequence around the phosphorylation site, the presence or absence of proteins that allow the anchoring of the kinase through the regulatory subunit, which regulates the kinase-substrate interaction, the differential subcellular localization of the catalytic subunits against different stimuli, and the expression levels of the substrate and the kinase. S.cerevisiae PKA is a holoenzyme composed of a regulatory subunit dimer, Bcy1, and two catalytic subunits, Tpk1, Tpk2, and Tpk3. The different subunits are differentially expressed under conditions such as thermal and saline stress or availability and type of carbon source. The expression regulation of each subunit from the holoenzyme is one of the control levels, which determine the specificity of the cAMP-PKA response. The general objective of this work was to contribute to elucidate the molecular mechanisms that control the specificity of the cAMP-PKA signaling pathway in S. cerevisiae. In this thesis we study the mechanism through which the cAMP-PKA pathway mediates its specific response to heat stress and thermal adaptation in yeast. We show that TPK1 mRNA levels are induced against heat stress at 37°C. This increase results from an increase in both TPK1 promoter activity and transcript half-life. However, no change in Tpk1 protein levels is detected. During heat stress TPK1 mRNA assembles into cytoplasmic granules. The granules are resistant to cycloheximide treatment and TPK1 transcript is found in greater proportion in the fractions containing monosomes or free RNA in a polysome profile, indicating translation inhibition. The regulation of TPK1 expression was also evaluated during heat stress conditions that promote thermotolerance. A yeast abruptly exposed to heat stress will respond less efficiently than if, prior to exposure to high temperature, it is subjected for a short period of time to a non-lethal temperature above the optimum. In this case, yeast acquires a greater ability to survive to heat stress. This phenomenon is known as thermotolerance induction. Under these conditions, carrying out two incubations at 37°C separated by recovery periods at 25°C, it was observed that the granules containing TPK1 mRNA are dynamic, assembling and disassembling during temperature changes. While mRNA levels increase in the 37°C incubation periods, Tpk1 protein levels are significantly increased in the final recovery period at 25°C. Among pathways that are activated in response to heat stress in S.cerevisiae is the CWI (Cell Wall Integrity) pathway. To deepen our knowledge of the molecular mechanisms that regulate TPK1 expression, the crossover between the CWI and cAMP-PKA pathways was analyzed. We show that Wsc3 sensor is required for the regulation of TPK1 expression during heat stress. From the MAPK cascade, which is part of the CWI pathway downstream the sensor, only the kinase Mkk1 and the transcription factor Swi4 play a role in TPK1 expression in response to this stress. The foci assembly in thermal stress depends on the sensor Wsc3. Tpk1 protein expression during thermotolerance is lower in a wsc3Δ mutant strain than in the WT strain. Changes in expression were correlated with PKA activity in vivo and consequently, as Tpk1 increased in thermotolerance, PKA activity in wsc3Δ mutant cells was lower. All these results show the CWI pathway participation in TPK1 expression during heat stress and provide another background to the crossover of CWI and PKA pathways. Finally we performed experiments to demonstrate that TPK1 subunit expression regulation in response to thermal stress results in a change in isoforms proportion that make up the holoenzyme. We show that the amount of the Tpk1 isoform in the holoenzyme is significantly higher during the second recovery period at 25°C, compared to any other conditions tested. The results as a whole indicate the existence of a mechanism that regulates Tpk1 subunit expression against a certain stimulus such as thermal stress. The increase in Tpk1-dependent PKA activity during cellular adaptation to heat stress could contribute to overall cellular fitness when more favorable environmental conditions are restored. The results indicate the existence of a mechanism for regulating TPK1 expression that allows adjusting the specificity of cAMP-PKA so that the cell achieves the best response to a given stimulus. Fil: Cañonero, Luciana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. 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Regulación transcripcional y post-transcripcional de la subunidad Tpk1 de PKA de Saccharomyces cerevisiae por estrés térmico

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