Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio
En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicasópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de losobjetivos del trabajo es determinar cómo analizar...
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
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Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2015
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MODELADO DE TECNICAS OPTICAS ANALISIS FLUCTUACIONES SISTEMAS DE REACCION-DIFUSION FLUORESCENCIA CORRELACION MODELING OF OPTICAL TECHNIQUES FLUCTUATION ANALYSIS REACTION-DIFFUSION SYSTEMS FLUORESCENCE CORRELATION |
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MODELADO DE TECNICAS OPTICAS ANALISIS FLUCTUACIONES SISTEMAS DE REACCION-DIFUSION FLUORESCENCIA CORRELACION MODELING OF OPTICAL TECHNIQUES FLUCTUATION ANALYSIS REACTION-DIFFUSION SYSTEMS FLUORESCENCE CORRELATION Pérez Ipiña, Emiliano Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio |
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MODELADO DE TECNICAS OPTICAS ANALISIS FLUCTUACIONES SISTEMAS DE REACCION-DIFUSION FLUORESCENCIA CORRELACION MODELING OF OPTICAL TECHNIQUES FLUCTUATION ANALYSIS REACTION-DIFFUSION SYSTEMS FLUORESCENCE CORRELATION |
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En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicasópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de losobjetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraerinformación cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenosobservados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadasdifunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizadoslas fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que seusan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudiode las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanzatambién sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica comoes el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración deun ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En losexperimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen apartir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuacionesde la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación quela caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámicode los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetrosde ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlaciónpueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de lospesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadasque reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros delsistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen deobservación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente porlos coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientesefectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variaciónde la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles oinmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyopeso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentracionesa partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión esposible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenosque involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posteriorgeneración de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, enparticular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada comofunción del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno delos mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudiosanteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango detiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora unacorreción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempostempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En eltrabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducciónen las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantáneade mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. Apartir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligaduraconsecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentalesde la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponenque la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es engran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio paraque expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite,por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínasinvolucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrolloembrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular,el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. Enmuchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de unmodelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde dondedifunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicarcuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 seanaliza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al teneren cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que lafluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para talfin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interaccióncon sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de laconcentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. Elmodelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicosrazonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd yla proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo quedescribe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribuciónde Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a esteión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permitecomparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados endistintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetrosexperimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadasaunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros. Palabras claves: Modelado de técnicas ópticas, análisis fluctuaciones, sistemas dereacción-difusión, fluorescencia, correlación |
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Ponce Dawson, Silvina |
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tesis:tesis_n5847_PerezIpina2023-10-02T20:12:04Z Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio Analysis and modeling of fluorescence experiments. Application to calcium signals Pérez Ipiña, Emiliano Ponce Dawson, Silvina MODELADO DE TECNICAS OPTICAS ANALISIS FLUCTUACIONES SISTEMAS DE REACCION-DIFUSION FLUORESCENCIA CORRELACION MODELING OF OPTICAL TECHNIQUES FLUCTUATION ANALYSIS REACTION-DIFFUSION SYSTEMS FLUORESCENCE CORRELATION En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicasópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de losobjetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraerinformación cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenosobservados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadasdifunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizadoslas fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que seusan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudiode las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanzatambién sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica comoes el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración deun ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En losexperimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen apartir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuacionesde la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación quela caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámicode los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetrosde ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlaciónpueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de lospesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadasque reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros delsistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen deobservación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente porlos coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientesefectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variaciónde la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles oinmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyopeso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentracionesa partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión esposible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenosque involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posteriorgeneración de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, enparticular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada comofunción del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno delos mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudiosanteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango detiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora unacorreción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempostempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En eltrabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducciónen las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantáneade mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. Apartir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligaduraconsecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentalesde la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponenque la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es engran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio paraque expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite,por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínasinvolucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrolloembrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular,el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. Enmuchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de unmodelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde dondedifunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicarcuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 seanaliza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al teneren cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que lafluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para talfin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interaccióncon sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de laconcentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. Elmodelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicosrazonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd yla proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo quedescribe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribuciónde Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a esteión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permitecomparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados endistintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetrosexperimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadasaunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros. Palabras claves: Modelado de técnicas ópticas, análisis fluctuaciones, sistemas dereacción-difusión, fluorescencia, correlación In this Thesis we study, from a theoretical point of view, different optical techniquesthat allow the observation in vivo of processes that occur in cells and embryos. Inall the techniques that we explore, fluorescence records or images are obtained. Oneof the aims of the work is to determine how to analyze the experimental data so asto extract quantitative information about biophysical parameters that are relevantfor the observed processes. In particular, we analyze how to do it when the observedmolecules diffuse and interact (react) with other species. In the various cases that weanalyze, fluctuations play a key role since they are used to extract information. Basedon the knowledge obtained through the study of fluctuations in fluorescence microscopyexperiments in this Thesis we also advance on another aspect that is relevant withinthe realm of biological signaling such as the time it takes for a cellular endogenousmechanism to “sense” the concentration of a ligand with a certain accuracy level. In the first part of the Thesis we focus on the study of the technique knownas Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). In FCS experiments one obtainsrecords of the fluorescence coming from a small volume from which one computes theautocorrelation function (AFC) of the fluorescence fluctuations. Fitting the ACF it ispossible to determine the correlation times and the weights with which they enter the ACF. Using a dynamical model of the processes that underlie the observations it ispossible to go from the fitting to biophysical parameters. In particular, the transportrate of the marked molecules can be determined from the correlation times and theirconcentrations from the weights. In Chapter 2 we study how the correlation timesdepend on the parameters of the system and of the experiment in a case in which themarked molecules diffuse and react. In particular, we show that the correlation timeschange from being determined exclusively by the free diffusion coefficients of the speciesinvolved to depend on the reaction rates. In Chapter 3 we study how the ACF variesdepending on whether the marked molecules interact with mobile or immobile sites. We find that, when the sites are immobile, there is one correlation time whose weightbecomes exactly equal to zero. This finite change has implications on how to estimateconcentrations from the ACF. In this Chapter we also study what is the accuracy withwhich concentrations can derived from the experiments depending on the length of theanalyzed records. In Chapter 4 we study the precision of the endogenous “reading” mechanisms thatinvolve the binding of effectors to sites on the cell that subsequently induce an endresponse that depends on the “read” concentration. We present, more specifically,expressions that allow us to estimate the error in the sensed concentration as a functionof the observation and characteristic times of the system. One the main contributions ofthis part of the work is that, differently from previous studies, our expressions describethe decay of the error for all observation times, not just the asymptotic behavior. Onthe other hand, we incorporate a correction that takes into account the nonlinearity ofthe system which is relevant for the early behavior of single binding sites. We show inthe Thesis how this “nonlinear” correction allows us to interpret the reduction in thefluctuation size observed in experiments performed in the fly Drosophila melanogasterwhen comparing those associated to the instantaneous production of mRNA withthose of the accumulated corresponding protein. Having an expression that describesthe behavior of the early fluctuations allows us to obtain an approximation of thewaiting time distribution between consecutive bindings of a single binding site. Thisapproximated distribution allows us to interpret experimental observations on theactivity of enzymes at the single molecule level without the need of assuming that themolecule fluctuates among innumerous different conformers. The observation of processes in vivo by means of fluorescence microscopy is doableto a great extent because it is possible to manipulate organisms and cells so that theproteins of interest are expressed with a fluorescent tag. This allows the direct study ofthe spatio-temporal properties of gradients of proteins involved in morphogenesis. Acase that has been analyzed with great detail is that of the early embryonic developmentof the fruit fly, Drosophila melanogaster, particularly, of the gradient of the Bicoid (Bcd)protein along the antero-posterior axis. In several studies the experimental observationsof this gradient is interpreted within the SDD model in which Bcd is synthesized at oneend of the embryo from which it diffuses while it is degraded. The SDD model cannotexplain quantitatively all the observed characteristics of the gradient. In Chapter 5 weanalyze in which ways the information that can be extracted from the images changesif we take into account that Bcd not only diffuses but binds to sites on its way as well. To this end we introduce an extension of the SDD model which we call SDID becauseit includes the interaction with binding sites with which we study the spatio-temporaldynamics of the concentration of Bcd as well as its ability to act as transcription factor. The model reproduces the observations with realistic parameter values and opens up thepossibility of re-interpreting the relationship between Bcd and the protein, Hunchback,for which production Bcd is a transcription factor. Finally, in Chapter 6 we analyze the validity and limitations of a model that describesthe fluorescence fluctuations of Ca2+ images obtained using dyes that change theirintensity of emission upon Ca2+ binding (single-wavelength Ca2+ dyes). The model is thebasis of a method that allows the quantitative comparison of Ca2+ imaging experimentsperformed under different conditions and which helps with the choice of experimentalparameters for each set-up. The detailed analysis presented en this Chapter shows thatthe model reproduces correctly the observed fluctuations albeit not always for a uniqueset of parameter values.keywords: Modeling of Optical Techniques, Fluctuation Analysis, Reaction-diffusion Systems, fluorescence, correlation Fil: Pérez Ipiña, Emiliano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015-10-22 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5847_PerezIpina |