Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae

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Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiologíainterna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balanceinterno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad deperturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio i...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Pautasso, María Constanza
Otros Autores:	Rossi, Silvia Graciela
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5804_Pautasso
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Dichosmecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que estáninvolucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés ydiferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares escontrolada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consisteen un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por losgenes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un únicogen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa seencuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario,tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes decarbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación asituaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. Laespecificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por variosfactores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa ydel sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción dela quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. Laregulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo sebuscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de lassubunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificarglobalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en laregulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de losniveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de losgenes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menorde la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben unaactividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorionegativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propiosgenes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, ymediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía derespuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1,interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción ríoabajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y sureclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de larespuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó unmarcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismofermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas queparticipan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar alfactor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 comorepresor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activomediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores detranscripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado deglucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente decarbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducciónde señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente decarbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, serealizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevosreguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuentede carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías queregulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology paradeterminar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a lascategorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo defosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron tambiéngenes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por lospromotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió comoreguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cadasubunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos deinositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de lassubunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos defosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a suvez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad deuna regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estosprocesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además enrelación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulacióninhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de laexpresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega unrol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino deseñalización cAMP-PKA.
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spelling	tesis:tesis_n5804_Pautasso2023-10-02T20:11:41Z Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae Transcriptional regulation of protein kinase a subunits from Saccharomyces cerevisiae Pautasso, María Constanza Rossi, Silvia Graciela Las células deben mantener un específico y delicado balance de su fisiologíainterna para el crecimiento y funcionamiento óptimos. El mantenimiento de este balanceinterno es crítico y variaciones del ambiente pueden resultar en una variedad deperturbaciones celulares que pueden romper el equilibrio interno celular, provocando deesta forma una interrupción de flujos metabólicos, desestabilización de estructurascelulares y perturbación de gradientes químicos, entre otros, que conducen a unainestabilidad general. Las células deben ser capaces de proteger y mantener lahomeostasis interna frente a la variabilidad de las condiciones externas. La levadura Saccharomyces cerevisiae, ha evolucionado sistemas de sensado y redes de señalizacióncomplejas para responder eficientemente a las variaciones repentinas y frecuentes en elambiente externo, como son fluctuaciones de temperatura, osmolaridad, acidez delambiente, presencia de tóxicos, y largos períodos de hambreado nutricional. Dichosmecanismos, le permiten controlar la expresión de numerosos genes que estáninvolucrados en la división celular, caminos metabólicos, resistencia a estrés ydiferenciación celular. En Saccharomyces cerevisiae una gran variedad de los procesos celulares escontrolada por la vía de la proteína kinasa A dependiente de cAMP (PKA), la que consisteen un heterotetrámero formado por dos subunidades catalíticas (C) codificadas por losgenes TPK1, TPK2 y TPK3, y por dos subunidades regulatorias (R) codificadas por un únicogen BCY1. Entre los estímulos mejor descriptos frente a los que la PKA se activa seencuentra la presencia de fuentes de carbono fermentables en el medio. Por el contrario,tanto para el cambio a metabolismo respiratorio que permite el consumo de fuentes decarbono no fermentables, como para dar una respuesta que permita la adaptación asituaciones de estrés térmico y osmótico, es necesario que la PKA se inactive. Laespecificidad de la respuesta frente a distintos estímulos es determinada por variosfactores como son la concentración local de cAMP, los niveles de expresión de la quinasa ydel sustrato, la presencia o ausencia de proteínas de anclaje que limitan la interacción dela quinasa con su sustrato y la secuencia alrededor del sitio de fosforilación de éste. Laregulación de los niveles de expresión génica de las subunidades de PKA en Saccharomyces cerevisiae ha sido poco estudiada hasta el momento. En este trabajo sebuscó caracterizar la actividad transcripcional de los promotores de los genes de lassubunidades de PKA en distintas condiciones de crecimiento, así como identificarglobalmente vías metabólicas y específicamente proteínas de importancia en laregulación. En primer lugar, mediante la técnica de genes reporteros y la medición de losniveles de mRNA, se determinó que los niveles de actividad de los promotores de losgenes de PKA son diferentes a lo largo del crecimiento, ordenándose de mayor a menorde la siguiente forma: TPK1, TPK2, TPK3 y BCY1. Empleando mutantes que exhiben unaactividad de PKA desregulada o nula, se describió el comportamiento autorregulatorionegativo isoforma-dependiente de la enzima sobre los niveles de expresión de sus propiosgenes. En condiciones de estrés térmico y salino, sólo el promotor TPK1 es activado, ymediante el empleo de cepas mutantes de deleción de proteínas involucradas en la vía derespuesta al estrés térmico, se determinó que la quinasa Rim15, y no la quinasa Yak1,interviene en su regulación. Más aún, Msn2/4, Gis1 y Sok2, factores de transcripción ríoabajo de ambas quinasas, participan en la activación del promotor TPK1, y sureclutamiento fue confirmado por experimentos de ChIP. Por otra parte, el estudio de larespuesta de los promotores al crecimiento en glicerol (metabolismo oxidativo), indicó unmarcado incremento de la actividad, respecto al crecimiento en glucosa (metabolismofermentativo). El uso de mutantes de deleción de genes que codifican para proteínas queparticipan en la transducción de la señal de fuente de carbono permitió identificar alfactor de transcripción Mig1 como represor de los promotores TPK1 y TPK2; a Mig2 comorepresor de los promotores de TPK2 y BCY1, y a Mig3 como represor del promotor de BCY1. Se corroboró la presencia de Mig1 en el promotor TPK1 transcripcionalmente activomediante ensayos de ChIP. La quinasa Snf1y sus efectores río abajo, los factores detranscripción Cat8 y Sip4, que cumplen un rol importante en la respuesta al hambreado deglucosa, regulan la actividad de los cuatro promotores en presencia de esta fuente decarbono. Teniendo en cuenta que la PKA está implicada en numerosas vías de transducciónde señales, y habiendo corroborado que las vías de respuesta a estrés y a fuente decarbono regulan la actividad de los promotores de los genes de sus subunidades, serealizó un estudio a nivel genómico a través del empleo de tecnología robótica (técnica Reporter-Synthetic Genetic Array), con el objetivo de identificar de forma global nuevosreguladores de la transcripción. Este estudio se llevó a cabo con células crecidas en fuentede carbono fermentable. Este análisis masivo permitió identificar distintas vías queregulan diferencialmente la actividad de los cuatro promotores de las subunidades de PKA. Los reguladores identificados fueron clasificados según la base Gene Ontology paradeterminar el enriquecimiento en distintas categorías. Distintos genes asociados a lascategorías de transcripción, función mitocondrial, función vacuolar y metabolismo defosfato afectan la actividad de los cuatro promotores. A su vez se identificaron tambiéngenes pertenecientes a distintas categorías regulatorias que no son compartidas por lospromotores, como metabolismo de lípidos, que afecta la transcripción de TPK1, TPK2 y TPK3. Fue llamativo además, que dentro de una misma categoría que surgió comoreguladora de los cuatro promotores, los genes identificados son diferentes para cadasubunidad de PKA. Del análisis surgieron también los metabolitos inositol, polifosfatos deinositol, colina y fosfato como señales que regulan la transcripción de los genes de lassubunidades de PKA. De este trabajo se desprende que muchos de los blancos defosforilación conocidos de PKA que forman parte de estas rutas metabólicas, juegan a suvez un rol en la regulación transcripcional de sus subunidades, sugiriendo la posibilidad deuna regulación recíproca en la que PKA coordinaría diferentes vías de señalización y estosprocesos a su vez regularían la expresión de la quinasa. Este concepto está además enrelación con los resultados de la primera parte del trabajo, que muestran una regulacióninhibitoria de los promotores de PKA por la propia actividad de la quinasa. Como conclusión general se puede afirmar que la regulación diferencial de laexpresión de las subunidades que conforman la quinasa dependiente de cAMP juega unrol importante en la determinación de la especificidad de la respuesta en el camino deseñalización cAMP-PKA. Yeast cells must maintain a specific and delicate balance of their internalphysiology to the optimal growth and function. Variations in the environment conditionscan result in a variety of cellular perturbations that break the cellular internal equilibrium,and the cells use myriad strategies to maintain these internal conditions in the face ofvariable and often harsh external. The yeast Saccharomyces cerevisiae has evolved sensingsystems and complex signaling pathways to efficiently respond to drastic and abruptlyvariations in the external environment, as fluctuations of the temperature, osmolarity,acidity, presence of toxics compounds, and large periods of starvation. Whenenvironmental conditions change abruptly, the cell must rapidly adjust its genomicexpression program to adapt to the new conditions. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cAMP dependent protein kinase A (PKA)controls a wide variety of cellular processes. Yeast PKA consists in a heterotetramer withtwo catalytic (C) subunits encoded by the TPK1, TPK2 and TPK3 genes, and a dimer ofregulatory (R) subunit encoded by the BCY1 gene. One of the best described stimuliactivating the PKA is the presence of a fermentable carbon source in the growth medium;while it is necessary to inactivate PKA to allow the switch from fermentative to respiratorymetabolism to occur, and to respond to heat and osmotic stress. In general, the specificityof the response to numerous stimuli is determined by several factors as the local cAMPconcentration, the expression levels of the kinase and its substrates, the presence orabsence of scaffold proteins which limit the interaction among the kinase and itssubstrates, and the sequence around the phosphorylation site in the substrate. Little isknown about the expression levels of the genes encoding PKA subunits. The aim of thiswork was to characterize the regulation of the promoters transcriptional activity of thegenes encoding the subunits of PKA in different growth conditions, including differentcarbon source and stress, as well as the globally identification of novel metabolicpathways and specific proteins that act as regulators of the PKA subunits transcription. Asa first step, employing the reporter gene approach and measuring mRNA levels wedetermined that the expression level of PKA subunit promoters is different during thegrowth curve, having TPK1 the highest, then TPK2 and TPK3, and belonging to BCY1 thelowest one. Taking advantage of mutant strains that exhibit a deregulated activity of PKA,or a null activity of PKA, we described the negative isoform-dependent autoregulatorybehavior of the enzyme in the expression regulation of its own genes. In heat and osmoticstress conditions, only TPK1 promoter is activated. Employing several strains with simpledeletions of genes involved in the heat stress response, we determined that the kinase Rim15 and not the kinase Yak1, participates in TPK1 regulation. Moreover, Msn2, Msn4, Gis1 and Sok2, which are transcription factors downstream of both Rim15 and Yak1kinases, contribute to the upregulation of TPK1 promoter, and ChIP assays revealed itspresence on the promoter. On the other hand, the study of the promoters activity in thepresence of glycerol as carbon source (respiratory metabolism), showed a markedincrement in the promoters activity in comparison with the growth in glucose (fermentative metabolism). Using deletion mutants of proteins involved in the carbonsource signal transduction pathway, we identify the Mig1 transcription factor as arepressor of the TPK1 and TPK2 promoters; Mig2, as a repressor of TPK2 and BCY1promoters, and Mig3, as a repressor of BCY1 promoter. By ChIP assays we corroborate thepresence of Mig1 on the transcriptionally active TPK1 promoter. The kinase Snf1, and itsdownstream effectors, the transcription factors Cat8 and Sip4, all of them having animportant role under glucose starvation, regulate the activity of the four PKA subunitspromoters in the presence of this carbon source. Taking into account the implication of PKA in several transduction pathways, andthat the heat stress response pathway and the carbon source pathway are implicated inthe regulation of the activity of the promoters of the genes encoding PKA subunits, wecarried out a genomic study using robotic technology (Reporter-Synthetic Genetic Arraytechnique), with the aim of globally identify novel regulators of the transcription. Thisstudy was performed with cells grown in fermentable carbon source. The massive analysislet us discovering distinct pathways that differentially regulate the activity of the fourpromoters of the PKA subunits. The identified regulators were classified according to Gene Ontology database to determine enrichment in categories. Distinct genes belonging totranscription, mitochondria functioning, vacuolar functioning and phosphate metabolismaffected the activity of the four promoters. Besides we identified genes in differentregulatory categories which are not shared by the four promoters, as lipid metabolismwhich affects the TPK1, TPK2 and TPK3 transcription. Moreover the list of genes belongingto categories regulating the four promoters is not equal. Further characterization of theresults pointed to inositol and inositol polyphosphates, choline and phosphate as novelupstream signals that regulate transcription of PKA subunit genes. In general, from thiswork we conclude that many of the known targets of PKA phosphorylation are associatedwith the transcriptional regulation of PKA subunits, opening the possibility of a reciprocalregulation in which PKA would be coordinating different metabolic pathways and theseprocesses would in turn, regulate expression of the kinase subunits. This concept is inconcordance with the results of the first part of this work that showed an inhibitoryregulation of the PKA promoters by its own kinase activity. The overall conclusion is that the differential expression regulation of the PKAsubunits plays an important role in determining the specificity of the response in thecAMP-PKA signaling transduction pathway. Fil: Pautasso, María Constanza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2015-07-07 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5804_Pautasso

Regulación transcripcional de las subunidades de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae

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