Identificación de péptidos bloqueantes del sistema de secreción de tipo III y de la adherencia a epitelios de Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) y Escherichia coli enteropatógeno (EPEC)

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Escherichia coli Enteropatógeno (EPEC) y Escherichia coli Enterohemorrágico (EHEC) se encuentran asociadas con diarrea en seres humanos. EPEC es una de las principales causas de diarrea infantil en países desarrollados, mientras que EHEC es responsable de enfermedades cuyo espectro clínico incluye d...

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Larzábal, Mariano
Otros Autores:	Cataldi, Ángel Adrián
Formato:	Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010
Materias:	PEPTIDOS COILED-COIL SSTT EPEC Y EHEC SUH PEPTIDES COILED TTSS EPEC AND EHEC HUS
Acceso en línea:	https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4812_Larzabal
Aporte de:	Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Ambos patotipos de E. coli, al igual que Citrobacter rodentium, poseen un isla de patogenicidad conocida como Locus of enterocyte effacement (LEE). El LEE codifica para el sistema de secreción de tipo III (SSTT), cuya función es traslocar proteínas efectoras a los enterocitos, provocando la subversión celular. Este resulta en la formación de lesiones características de attaching and effacement (A/E) en el epitelio intestinal, que consisten en la destrucción de las microvellosidades y la formación de pedestales de actina polimerizada por debajo del sitio de contacto entre la bacteria y la célula. El SSTT es una estructura compleja con más de 20 proteínas que forman un sistema de 'aguja y jeringa' que permite inyectar proteínas efectoras directamente en la célula hospedadora. El LEE contiene cinco grandes operones que han sido completamente secuenciados: LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 y LEE5. EspA, EspB y EspD son algunas de las proteínas codificadas por el LEE4 que componen la parte del traslocon del SSTT. EspA, es la proteína mayoritaria, y sus polímeros forman filamentos huecos (estructura aguja), que están presentes de manera transitoria. EspB y EspD, se asocian al extremo del filamento y están involucrados en la formación de poros en las membranas de las células infectadas. El extremo proximal del filamento de EspA se apoya sobre el cuerpo basal formado por polímeros de la proteína EscF, que también se encuentra codificado en el LEE4. La proteína de membrana externa intimina, se encuentra codificada en el LEE5, y es responsable de la adherencia íntima de la bacteria al enterocito, así como también su propio receptor Tir, que es traslocado a través de la SSTT al citoplasma para luego anclarse en la membrana celular. Con el fin de utilizar a los factores de virulencia responsables de la lesión A/E como blancos de terapias de intervención, se determinó la inmunogenicidad y la antigenicidad de las proteínas del sistema de secreción de tipo III y la adhesina intimina empleando calostro de bovinos naturalmente infectados o colonizados. Los resultados demostraron que el calostro de bovinos no vacunados, proveniente de ganado lechero y cárnico de la región Pampeana de la Argentina, contiene una alta frecuencia de anticuerpos contra las proteínas intimina-γ C280, EspA y EspB. Por otro lado, también se obtuvieron sueros policlonales a partir de conejos inmunizados con proteína EspA, EspB y N-EspD recombinantes, demostrando la capacidad por parte de estas proteínas de inducir elevados títulos de respuesta inmune humoral en anticuerpos IgG. En este trabajo, se observó que tanto el calostro bovino como anticuerpos policlonales específicos contra proteínas del SSTT, inhibieron la acción mediada por SSTT de EPEC 2348/69 sobre los GRs de manera dependiente de la dosis, demostrando que compuestos dirigidos contra el SSTT pueden inhibir su funcionalidad. Estos efectos protectores han sido parcialmente atribuidos a la presencia de anticuerpos contra componentes del SSTT, ya que una reducción significativa en la actividad inhibitoria fue obtenida cuando el calostro o los sueros policlonales fueron depletados de IgG total. La inmunogenicidad, antigenicidad y exposición en superficie de varios de los componentes responsables de la lesión A/E, los convierte en potenciales candidatos para vacunas, y moléculas blanco para péptidos y otros compuestos. Por lo tanto, resulta atractiva la estrategia de utilizar a los factores de virulencia como blanco de terapias de intervención. Con el objetivo de impedir el desencadenamiento de la acción del SSTT por parte de EHEC y EPEC, se utilizó la técnica de phage display para disponer de péptidos de 12 aminoácidos seleccionados específicamente contra proteínas estructurales y efectoras del SSTT, como EspA y EspB, susceptibles de ser bloqueadas. Si bien, los péptidos obtenidos por phage display tuvieron una alta afinidad hacia las proteínas blanco, no consiguieron neutralizar la patogénesis de EPEC in vitro, indicando que no necesariamente la interacción entre péptidos y proteínas blanco afecta la funcionalidad del SSTT. Teniendo en cuenta estos resultados, se trató de reducir el rango de especificidad de péptidos hacia regiones altamente conservadas y funcionalmente importantes de proteínas estructurales del inyectosoma, como son las regiones coiled-coil que consisten en α-hélices hidrofóbicas con repeticiones de siete aminoácidos, que participan de las interacciones proteína-proteína especialmente en la formación de complejos de multímeros. En este estudio, se examinaron los péptidos sintéticos, diseñados para bloquear la formación del SSTT. Los péptidos CoilA y CoilB, representan la región coiled-coil del C-terminal de la proteína traslocadora EspA y el péptido CoilD, correspondiente a la región coiled–coil del extremo N-terminal de la proteína EscF, fueron efectivos en la inhibición de la hemólisis de glóbulos rojos dependiente del SSTT de EPEC E2348/69 y EHEC O157:H7. Los péptidos de CoilA y CoilB también redujeron la formación de pedestales de actina cuando fueron pre-incubados con las bacterias EPEC E2348/69 y afectaron la traslocación por medio del SSTT a las células epiteliales de la proteína efectora Tir. A su vez, CoilA y CoilB fueron capaces de bloquear el ensamble del filamento de EspA, evitando la polimerización in vitro de la proteína EspA recombinante y por microscopía electrónica se observó una reducción en la longitud de los filamentos de EspA. Esto sugiere que los péptidos coiled-coil pueden prevenir el montaje y por lo tanto la funcionalidad del TTSS. A su vez, ensayos de western blot demostraron que los péptidos también inhibieron la correcta secreción de las proteínas EspB y EspD en EPEC E2348/69 y EspD en C. rodentium. Estos resultados motivaron a desarrollar un ensayo de protección contra C. rodentium in vivo, como modelo de infección para bacterias que contienen LEE. El tratamiento vía oral de ratones con una combinación de péptidos CoilA y CoilB, previa y durante la infección con C. rodentium, previno de la lesión A/E colónica. Estos resultados demostraron que el tratamiento preventivo y post inoculación con los péptidos coiled-coil inhibe la formación del SSTT de C. rodentium in vivo, actuando con un efecto protector contra la formación de la lesión A/E en ratones. En conclusión, el diseño de moléculas que perjudiquen la asociación íntima de los patógenos a la mucosa intestinal probablemente tendrán un efecto importante en las estrategias disponibles contra microorganismos patógenos, y existe la posibilidad de que los inhibidores específicos contra un mecanismos de virulencia sean efectivos por un largo tiempo antes que la resistencia se convierte en un problema, ya que habría poca o ninguna presión selectiva al no afectar la viabilidad, reduciéndose así el desarrollo de resistencia a estos agentes antimicrobianos. La investigación orientada a la búsqueda de inhibidores contra distintos mecanismos de virulencia puede tener un alto potencial terapéutico y preventivo como en este caso, a la vez que puede servir como herramienta para dilucidar los sistemas regulatorios intrínsecos que modulan la virulencia EPEC y EHEC o de cualquier otra bacteria que posea un SSTT. Los péptidos coiled-coil son moléculas pequeñas, más fáciles de sintetizar que moléculas orgánicas complejas, y podrían ser parte de formulaciones nutracéuticas contra patógenos diarreagénicos. Por lo tanto, la interferencia en la formación y/o funcionalidad del SSTT podría evitar la manifestación de lesiones A/E, impedir la colonización del epitelio intestinal y en última instancia podrían prevenir la enfermedad. Incluso, reducir la carga bacteriana de animales próximos a ingresar a frigorífico o mantenidos en feed-lot, disminuyendo la posibilidad de contaminación de la carne.
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EPEC es una de las principales causas de diarrea infantil en países desarrollados, mientras que EHEC es responsable de enfermedades cuyo espectro clínico incluye diarrea, colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico (SUH), que es la principal causa de insuficiencia renal aguda de niños menores de 5 años en la Argentina. La expresión de la toxina Shiga (Stx) codificada por bacteriófagos integrados al cromosoma de cepas EHEC, es considerada la responsable de la colitis hemorrágica y el SUH. El principal reservorio de EHEC es ganado bovino sano a pesar de que un número limitado de serotipos se han asociado con diarrea en terneros jóvenes, mientras que el reservorio de EPEC son los niños sintomáticos y asintomáticos. Ambos patotipos de E. coli, al igual que Citrobacter rodentium, poseen un isla de patogenicidad conocida como Locus of enterocyte effacement (LEE). El LEE codifica para el sistema de secreción de tipo III (SSTT), cuya función es traslocar proteínas efectoras a los enterocitos, provocando la subversión celular. Este resulta en la formación de lesiones características de attaching and effacement (A/E) en el epitelio intestinal, que consisten en la destrucción de las microvellosidades y la formación de pedestales de actina polimerizada por debajo del sitio de contacto entre la bacteria y la célula. El SSTT es una estructura compleja con más de 20 proteínas que forman un sistema de 'aguja y jeringa' que permite inyectar proteínas efectoras directamente en la célula hospedadora. El LEE contiene cinco grandes operones que han sido completamente secuenciados: LEE1, LEE2, LEE3, LEE4 y LEE5. EspA, EspB y EspD son algunas de las proteínas codificadas por el LEE4 que componen la parte del traslocon del SSTT. EspA, es la proteína mayoritaria, y sus polímeros forman filamentos huecos (estructura aguja), que están presentes de manera transitoria. EspB y EspD, se asocian al extremo del filamento y están involucrados en la formación de poros en las membranas de las células infectadas. El extremo proximal del filamento de EspA se apoya sobre el cuerpo basal formado por polímeros de la proteína EscF, que también se encuentra codificado en el LEE4. La proteína de membrana externa intimina, se encuentra codificada en el LEE5, y es responsable de la adherencia íntima de la bacteria al enterocito, así como también su propio receptor Tir, que es traslocado a través de la SSTT al citoplasma para luego anclarse en la membrana celular. Con el fin de utilizar a los factores de virulencia responsables de la lesión A/E como blancos de terapias de intervención, se determinó la inmunogenicidad y la antigenicidad de las proteínas del sistema de secreción de tipo III y la adhesina intimina empleando calostro de bovinos naturalmente infectados o colonizados. Los resultados demostraron que el calostro de bovinos no vacunados, proveniente de ganado lechero y cárnico de la región Pampeana de la Argentina, contiene una alta frecuencia de anticuerpos contra las proteínas intimina-γ C280, EspA y EspB. Por otro lado, también se obtuvieron sueros policlonales a partir de conejos inmunizados con proteína EspA, EspB y N-EspD recombinantes, demostrando la capacidad por parte de estas proteínas de inducir elevados títulos de respuesta inmune humoral en anticuerpos IgG. En este trabajo, se observó que tanto el calostro bovino como anticuerpos policlonales específicos contra proteínas del SSTT, inhibieron la acción mediada por SSTT de EPEC 2348/69 sobre los GRs de manera dependiente de la dosis, demostrando que compuestos dirigidos contra el SSTT pueden inhibir su funcionalidad. Estos efectos protectores han sido parcialmente atribuidos a la presencia de anticuerpos contra componentes del SSTT, ya que una reducción significativa en la actividad inhibitoria fue obtenida cuando el calostro o los sueros policlonales fueron depletados de IgG total. La inmunogenicidad, antigenicidad y exposición en superficie de varios de los componentes responsables de la lesión A/E, los convierte en potenciales candidatos para vacunas, y moléculas blanco para péptidos y otros compuestos. Por lo tanto, resulta atractiva la estrategia de utilizar a los factores de virulencia como blanco de terapias de intervención. Con el objetivo de impedir el desencadenamiento de la acción del SSTT por parte de EHEC y EPEC, se utilizó la técnica de phage display para disponer de péptidos de 12 aminoácidos seleccionados específicamente contra proteínas estructurales y efectoras del SSTT, como EspA y EspB, susceptibles de ser bloqueadas. Si bien, los péptidos obtenidos por phage display tuvieron una alta afinidad hacia las proteínas blanco, no consiguieron neutralizar la patogénesis de EPEC in vitro, indicando que no necesariamente la interacción entre péptidos y proteínas blanco afecta la funcionalidad del SSTT. Teniendo en cuenta estos resultados, se trató de reducir el rango de especificidad de péptidos hacia regiones altamente conservadas y funcionalmente importantes de proteínas estructurales del inyectosoma, como son las regiones coiled-coil que consisten en α-hélices hidrofóbicas con repeticiones de siete aminoácidos, que participan de las interacciones proteína-proteína especialmente en la formación de complejos de multímeros. En este estudio, se examinaron los péptidos sintéticos, diseñados para bloquear la formación del SSTT. Los péptidos CoilA y CoilB, representan la región coiled-coil del C-terminal de la proteína traslocadora EspA y el péptido CoilD, correspondiente a la región coiled–coil del extremo N-terminal de la proteína EscF, fueron efectivos en la inhibición de la hemólisis de glóbulos rojos dependiente del SSTT de EPEC E2348/69 y EHEC O157:H7. Los péptidos de CoilA y CoilB también redujeron la formación de pedestales de actina cuando fueron pre-incubados con las bacterias EPEC E2348/69 y afectaron la traslocación por medio del SSTT a las células epiteliales de la proteína efectora Tir. A su vez, CoilA y CoilB fueron capaces de bloquear el ensamble del filamento de EspA, evitando la polimerización in vitro de la proteína EspA recombinante y por microscopía electrónica se observó una reducción en la longitud de los filamentos de EspA. Esto sugiere que los péptidos coiled-coil pueden prevenir el montaje y por lo tanto la funcionalidad del TTSS. A su vez, ensayos de western blot demostraron que los péptidos también inhibieron la correcta secreción de las proteínas EspB y EspD en EPEC E2348/69 y EspD en C. rodentium. Estos resultados motivaron a desarrollar un ensayo de protección contra C. rodentium in vivo, como modelo de infección para bacterias que contienen LEE. El tratamiento vía oral de ratones con una combinación de péptidos CoilA y CoilB, previa y durante la infección con C. rodentium, previno de la lesión A/E colónica. Estos resultados demostraron que el tratamiento preventivo y post inoculación con los péptidos coiled-coil inhibe la formación del SSTT de C. rodentium in vivo, actuando con un efecto protector contra la formación de la lesión A/E en ratones. En conclusión, el diseño de moléculas que perjudiquen la asociación íntima de los patógenos a la mucosa intestinal probablemente tendrán un efecto importante en las estrategias disponibles contra microorganismos patógenos, y existe la posibilidad de que los inhibidores específicos contra un mecanismos de virulencia sean efectivos por un largo tiempo antes que la resistencia se convierte en un problema, ya que habría poca o ninguna presión selectiva al no afectar la viabilidad, reduciéndose así el desarrollo de resistencia a estos agentes antimicrobianos. La investigación orientada a la búsqueda de inhibidores contra distintos mecanismos de virulencia puede tener un alto potencial terapéutico y preventivo como en este caso, a la vez que puede servir como herramienta para dilucidar los sistemas regulatorios intrínsecos que modulan la virulencia EPEC y EHEC o de cualquier otra bacteria que posea un SSTT. Los péptidos coiled-coil son moléculas pequeñas, más fáciles de sintetizar que moléculas orgánicas complejas, y podrían ser parte de formulaciones nutracéuticas contra patógenos diarreagénicos. Por lo tanto, la interferencia en la formación y/o funcionalidad del SSTT podría evitar la manifestación de lesiones A/E, impedir la colonización del epitelio intestinal y en última instancia podrían prevenir la enfermedad. Incluso, reducir la carga bacteriana de animales próximos a ingresar a frigorífico o mantenidos en feed-lot, disminuyendo la posibilidad de contaminación de la carne. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) and Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) are associated with diarrhea in humans. EPEC is one of the leading causes of childhood diarrhea in developed countries, while EHEC is responsible for the clinical spectrum disease include diarrhea, hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome (HUS), which is the main cause of acute renal failure in children under 5 years in the Argentina. The expression of Shiga toxin (Stx) encoded by bacteriophages integrated in the chromosome strains EHEC is considered responsible for hemorrhagic colitis and HUS. The main reservoir of EHEC is healthy cattle while a limited number of serotypes have been associated with diarrhea in young calves while EPEC reservoir is symptomatic and asymptomatic children. Both diarrheagenic E. coli, as well as Citrobacter rodentium, possess a pathogenicity island known as the locus of enterocyte effacement (LEE). The LEE encodes type III secretion system (TTSS) whose function is to translocate effector proteins to the enterocytes, causing cellular subversion. This results in the formation of characteristic attaching and effacement lesions (A/E) in the intestinal epithelium, which consist of the microvilli destruction and formation of actin polymerized than contact between bacteria and the cell site pedestals. The TTSS is a complex structure with more than 20 proteins that forms a system of 'needle and syringe' which allows injecting effector proteins directly into the host cell. The LEE contains five major operons which have been fully sequenced: LEE1 LEE2, LEE3 LEE4 and LEE5. EspA, EspB and EspD are some of the proteins encoded by the LEE4 comprising part of the TTSS translocon. EspA, is the major protein and its polymers are hollow filaments (needle structure), which are present on a transitional basis. EspB and EspD, are associated with the end of the filament and are involved in the formation of pores in the membranes of the infected cells.The proximal end of the EspA filament relies on basal body formed by the EscF polymers, protein that is also encoded in the LEE4. The outer membrane protein, Intimin, is encoded in the LEE5 and is responsible for intimate adhesion to the enterocytes as well as its own receptor Tir, which is translocated through TTSS into the cytoplasm to then anchor into the cell membrane. In order to use the virulence factors responsible for the A/E lesion as targets of intervention therapies, the immunogenicity and antigenicity of TTSS proteins and intimin using naturally infected or colonized bovine colostrum. The results showed that bovine colostrum from unvaccinated dairy and meat cattle from Argentina contains a high frequency of antibodies against intimin-γ C280, EspA and EspB proteins. On the other hand polyclonal IgG antibodie from in rabbits immunized with EspA, EspB and N-EspD recombinant proteins, demonstrating the ability of these proteins to induce a strong humoral immune response. In this work, it was observed that both bovine colostrum and specific polyclonal antibodies against proteins of the TTSS inhibited the lysis on the red blood cells (RBCs) mediated by TTSS of EPEC 2348/69, demonstrating that directing substances against the TTSS can inhibit its functionality. These protective effects have been partially attributed to the presence of antibodies against the TTSS components because a significant reduction in inhibitory activity was obtained when colostrum or polyclonal sera were IgG totally depleted. Immunogenicity, antigenicity and exhibition surface of various proteins responsible for the A/E lesion, demonstrated that they can be potential candidates for vaccines, and target molecules for peptides and other molecules. The strategy used to intervention therapies target virulence factors is therefore attractive. In order to prevent the triggering action from EHEC and EPEC TTSS, the technique of phage display was used to obtain peptides of 12 aminoacids selected specifically against structural and effector TTSS protein such as EspA and EspB, likely to be blocked. Although peptides obtained by phage display had a high affinity towards target proteins, did not neutralize the pathogenesis of EPEC in vitro, indicating that not necessarily interaction between peptides and target proteins affects the functionality of the TTSS. Given these results, the range of specificity of peptides was reduce to functionally important and highly conserved regions of the inyectosome-structural proteins such as coiled-coil regions, consisting of hydrophobic α- helices with repetitions of seven amino acids involved in protein-protein interactions especially in the formation of multimers complexes. This study examined the synthetic peptides, designed to block the formation of the TTSS. Peptides CoilA and CoilB, represent the coiled-coil region at the C-terminus of the protein EspA and the peptide CoilD, corresponding to the coiled-coil region of N-terminal EscF protein, were effective in RBCs hemolysis mediated by TTSS of EPEC E2348/69 and EHEC O157:H7. Peptides CoilA and CoilB also reduced formation of actin pedestals when they were pre-incubated with EPEC E2348/69 bacteria and affected translocation by the TTSS epithelial cells of the Tir effector. In turn, CoilA and CoilB were able to block the ensemble the filament of EspA, avoiding the polymerization in vitro of EspA recombinant protein. By electron microscopy a reduction in the length of the filaments of EspA was observed. This suggests the coiled-coil peptides can prevent the ensemble and thus the TTSS functionality. In turn, western blot assays showed that peptides also inhibited the correct secretion of EspB and EspD proteins from EPEC E2348/69 and EspD protein from C. rodentium. These results led to develop a test for protection against C. rodentium in vivo, as model of infection by bacteria containing LEE. Treatment by oral route of mice with a combination of peptides CoilA and CoilB prior and during the infection with C. rodentium, prevented colonic A/E lesion. These results showed that preventive treatment and post inoculation with the coiled-coil peptides inhibits the formation in vivo of TTSS from C. rodentium, acting with a protective effect against the formation of A/E lesion in mice. In conclusion, design molecules which harm the intimate association of pathogens to the intestinal mucosa probably will be an important effect on strategies available against pathogenic microorganisms. The specific inhibitors against virulence mechanism are effective for a long time before resistance becomes a problem, since there would be little or no selective pressure to affect the viability, thus reducing the development of resistance to antimicrobial agents. Research aimed at finding inhibitors against different mechanisms of virulence can have a high therapeutic and preventive potential as in this case. Also, it can used as a tool for elucidating the regulatory mechanisms that modulate the EPEC and EHEC virulence, and also for any other bacteria possessing a TTSS. Coiled-coil peptides are small molecules, easierad to synthesize than complex organic molecules, and could be part of nutraceutic formulations against diarrheagenic E. coli. Therefore, training and/or functionality of the TTSS interference could avoid A/E lesion manifestation, the colonization of the gut epithelium and ultimately could prevent the disease. Even could reduce the bacterial load of animals going to slaugtherhouse or at the feed-lot, decreasing the possibility of contamination of meat. Fil: Larzábal, Mariano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2010 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n4812_Larzabal

Identificación de péptidos bloqueantes del sistema de secreción de tipo III y de la adherencia a epitelios de Escherichia coli enterohemorrágico (EHEC) y Escherichia coli enteropatógeno (EPEC)

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