Rol de la quinasa de proteínas dependiente de AMPc (PKA) en la diferenciación de Candida albicans : Existencia de una nueva isoenzima de PKA

El objetivo principal de esta Tesis fue profundizar el estudio de losmecanismos bioquímicos involucrados en la transición dimórfica de Candidaalbicans.\nEste trabajo está basado en resultados previos de nuestro laboratorio en losque se había demostrado que la vía de señalización del AMPc está involu...

Descripción completa

Detalles Bibliográficos
Autor principal: Castilla Lozano, María del Rocío
Otros Autores: Cantore, María Leonor
Formato: Tesis doctoral publishedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2000
Acceso en línea:https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3329_CastillaLozano
Aporte de:
Aportado por : Biblioteca Digital - Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA) de Universidad de Buenos Aires .
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En consecuencia, continuamos nuestra investigación enfocando elestudio en la participación de la enzima blanco del AMPc, la quinasa de proteínadependiente de AMPc (PKA), en Ia transición levadura —>micelio.\nLos resultados de los experimentos realizados in vivo con la cepa salvaje\n1001 demostraron que:\n- La inhibición in vivo de la actividad de PKA utilizando inhibidoresespecíficos resultó en un bloqueo completo de la transición dimórfica enmedio mínimo cuando la inducción se llevó a cabo con NAcGlc. Cuando elinductor usado fue suero, la inhibición de la PKA no tuvo un efecto tandrástico.\n- La inhibición de la PKA no promovió efectos deletéreos en la célula ya queel agregado de suero pudo reiniciar la diferenciación en célulasbloqueadas ni produce efectos generalizados sobre el crecimiento ya quela gemación de las células levaduriformes no fue afectada.\n- La inhibición de la PKA resultó en un bloqueo generalizado de lafosforilación total de proteínas in vivo. EI agregado de dbAMPc al medioaumentó globalmente la fosforilación de proteínas y aún en su presencia lainhibición de la PKA promueve una desaparición completa de las proteínasfosforiladas.\nEstos experimentos permiten concluir que la PKA es un elemento crucial enla transducción de señales desencadenadas por NAcGlc y que su ubicación en lacascada de fosforilaciones es tal que controla otras quinasas, algunas de lascuales podrian estar involucradas en el dimorfismo.\nLos experimentos de germinación realizados con una mutante que carece delgen para la única subunidad catalítica (subunidad C) conocida hasta esemomento (gen TPK2), y los datos aportados por el Proyecto genoma de Candida ,permitieron demostrar la existencia y expresión de un segundo gen para C noconocido. Es más, esta nueva C tiene también un rol positivo en la diferenciación.\nDemostramos también que la subunidad R es una fosfoproteína in vivo. Laautofosforilación de la subunidad R resultó en una marcada disminución de suafinidad por C Io que hizo a la holoenzima mas sensible a disociación por AMPc.\nIn vivo esta situación permitiría a la holoenzima ser disociada con pequeñasfluctuaciones de AMPc. The main objective of this Thesis was to go deep into studies on thebiochemical mechanisms involved in the dimorphic transition of Candida albicans.\nThis work is based on previous results from our laboratory that demonstratedthat the CAMP signaling pathway is involved the fungus response to someenvironmental factors which control its morphology. Consequently, to go on withour investigations we focussed our interest on the participation of the cAMP targetenzyme, the cAMP-dependent protein kinase (PKA) on the yeast-to-hyphatransition.\nThe results of the in vivo experiments performed with the C. albicans wild typestrain 1001, demonstrated that:\n- The inhibition of the PKA activity with specific inhibitors resulted in acomplete blockade of the dimorphic transition in minima medium when theprocess was induced with GlcNAc. When the inducer was serum, theinhibition of PKA was not so drastic.\n- The inhibiton of PKA did not promote deleterious effects on the cells sincethe addition of serum allowed blocked cells to resume differentiation, norproduced generalized effects on growth since duplication of yeast cells wasnot affected.\n- The inhibition of PKA resulted in a generalized blockade of the total proteinphosphorylation in vivo. The addition of dbcAMP to the medium raisedprotein phosphorylation as a whole, but even in its presence PKA inhibitionpromoted the disappearance of phosphorylated proteins.\nThese experiments allow us to conclude that PKA is a crucial element in thesignal transduction triggered by GlcNAc and that its location in thephosphorylation cascade is such that it control other kinases , some of whichcould be involved in dimorphism.\nGermination experiments performed using a mutant strain lacking the gene forthe sole catalytic subunit (C) known up this moment (TPK2 gene), and dataarising from the Candida genome Project, allowed us to demonstrate theexistence of a second gene for C still unknown. What is more, this new C isoformalso have a positive role on differentiation of C. albicans.\nWe also found out that R subunit is a phosphoprotein in vivo.\nAutophosphorylation of R resulted in an important decrease in its affinity for Cmaking the holoenzyme more sensitive to dissociation by cAMP. In vivo thissituation could allow the holoenzyme to be dissociated by small fluctuations incAMP levels. Fil:Castilla Lozano, María del Rocío. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 2000 info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/publishedVersion application/pdf spa info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3329_CastillaLozano

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