Identificación y caracterización bioinformática de nuevos efectores asociados a los sistemas de secreción de tipo VI en Escherichia coli productoras de toxina Shiga
Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno bacteriano implicado en enfermedades de transmisión alimentaria, cuya virulencia se debe principalmente a la producción de toxina Shiga (Stx). Esta toxina es responsable del desarrollo de síndrome urémico hemolítico (SUH), una complic...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2024
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n7604_Riviere https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n7604_Riviere_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | Escherichia coli productora de toxina Shiga (STEC) es un patógeno bacteriano implicado en enfermedades de transmisión alimentaria, cuya virulencia se debe principalmente a la producción de toxina Shiga (Stx). Esta toxina es responsable del desarrollo de síndrome urémico hemolítico (SUH), una complicación pediátrica grave de importancia en Argentina. E. coli enterohemorrágico (EHEC) pertenece a un subgrupo de STEC y dentro de este subgrupo se encuentra el serotipo O157:H7, que está asociado con brotes de SUH. Se ha identificado que el ganado bovino es el principal reservorio de STEC y la principal fuente de diseminación al ambiente y contaminación alimenticia. En el presente trabajo de tesis doctoral se investigaron dos cepas: EHEC O157:H7 EDL933 y STEC O22:H8 cepa 154, con el objetivo de identificar y caracterizar sus diferentes sistemas de secreción de tipo VI (SST6) y factores de virulencia (efectores) asociados. El SST6 es una nanomáquina proteica capaz de translocar moléculas efectoras que están vinculadas con la virulencia y que podrían aumentar su capacidad de colonización y supervivencia en un nicho específico. El análisis bioinformático realizado sobre el genoma de EHEC O157:H7 EDL933, permitió identificar una copia completa del operón SST6-2 codificado en el genoma bacteriano. Las predicciones bioinformáticas sobre la función del SST6-2, basándose en la homología de secuencia con otros patógenos que poseen este tipo de SST6-2 han revelado su asociación con la supervivencia de la bacteria en fagosomas de macrófagos murinos. Para demostrar esta predicción, se generaron cepas mutantes de EHEC para el SST6-2 mediante la metodología de edición génica CRISPR/Cas9, lo que ha permitido confirmar la relevancia que posee el SST6-2 en la supervivencia de la bacteria en macrófagos murinos. Para elucidar el mecanismo molecular de la supervivencia EHEC O157:H7 EDL933 en el macrófago se realizó un análisis de RNA-seq de la interacción hospedador-patógeno. Además, se tomó la decisión estratégica de replicar in vitro las condiciones de un fagosoma tardío. Este enfoque permitió obtener el perfil transcriptómico global de EHEC O157:H7 EDL933 fagocitada y expuesta a estrés extremo, observando una activación parcial de los genes estructurales del SST6-2. Para identificar nuevos efectores se empleó una combinación de predicciones bioinformáticas y datos experimentales recopilados de bibliografía. Esto condujo a la identificación de 98 potenciales efectores (26 provenientes de predicciones bioinformáticas y 72 de datos experimentales) del SST6-2 en EHEC O157:H7 EDL933. Al contrastar estos potenciales efectores con el resultado del RNA-seq considerando su sobreexpresión, localización subcelular se seleccionaron 38 candidatos a efectores del SST6-2. Teniendo en cuenta su función y la predicción sobre si estos potenciales efectores podrían contribuir a la virulencia bacteriana se redujo ese número a 6 potenciales efectores. Entre ellos YbjW que codifica para una proteína con actividad hidroxilamina reductasa y se encuentra asociado con la detoxificación frente al estrés nitrosativo. Por otro lado, se identificaron 5 candidatos asociados con procesos metabólicos como FumB, PurB y SucD y otros como YbeL e YccJ con funciones desconocidas. Los resultados obtenidos condujeron a la formulación de un modelo de acción del SST6-2 donde su estructura ya se encuentre previamente ensamblada en la membrana bacteriana, mientras que las expresión y asociación de efectores al complejo ocurra al momento de ser gatillada la respuesta de translocación. Durante la segunda etapa del desarrollo de la tesis doctoral se investigó la presencia y accionar de potenciales efectores del SST6 en STEC O22:H8 cepa 154. Resultados previos reportados por Martorelli y colaboradores demostraron que el ganado bovino portador de STEC O22:H8 no fue colonizado por EHEC O157:H7, aunque el mecanismo detrás de esta exclusión competitiva era desconocido. En esta tesis doctoral se pudo evidenciar las bases moleculares de STEC O22:H8 154 durante la competencia bacteriana por el nicho contra EHEC O157:H7. El análisis bioinformático del genoma de STEC O22:H8 reveló la presencia de dos SST6 completos: el SST6-1 y SST6-2. La presencia de un SST6-1 en una cepa STEC O22:H8 es un evento significativo porque no se ha reportado previamente. Además, el análisis realizado permitió la identificación de potenciales efectores antibacterianos dentro y fuera de los operones del SST6. Otros estudios han informado que el SST6-1 está asociado con un fenotipo de competencia bacteriana, en el cual las cepas que lo poseen exhiben la capacidad de eliminar a otras. Para demostrar esta predicción se realizó un ensayo de competencia in vitro a través del cual se pudo confirmar la actividad antibacteriana de STEC O22:H8 154 contra EHEC O157:H7. Esto sugiere que STEC O22:H8 154 podría desplazar del nicho de colonización a EHEC O157:H7 mediante la competencia interbacteriana, al disponer de un SST6-1 y potenciales efectores antibacterianos. |
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