Mecanismos involucrados en la exportación de la interleuquina-1 beta (IL-1ß) en los neutrófilos humanos
La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como u...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2019
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6679_Iula https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n6679_Iula_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como una molécula precursora inactiva (proIL-1β), que tras ser procesada proteolíticamente, es secretada por mecanismos definidos de forma incompleta, que son independientes de la vía canónica de secreció celular que involucra al retículo endoplasmático y al aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, investigamos los mecanismos involucrados en la secreción de IL-1β en neutrófilos aislados de sangre periférica humana. Nuestros estudios indicaron que la inhibición de la inducción de autofagia mediante el uso de inhibidores como 3-metiladenina y Wortmanina, o el bloqueo de lujo autofágico con Bafilomicina A1 (Baf A1) o E-64d, redujeron marcadamente la secreción de IL-1β inducida por LPS o LPS+ATP luego de 5 hs de cultivo. En neutrófilos diferenciados a partir de la línea celular PLB985, la reducción de la expresión (knockdow) de ATG5 mediante ARN de interferencia inhibió la secreción de IL-1β. En respuesta a la estimulación de neutrófilos con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando con el marcador de vesículas autofágicas LC3B al ser analizadas por microscopia laser confocal a las 4 horas postestimulación (p.e.). En contraposición al impacto ejercido por la inhibición de la autofogia, su inducción por privación de nutrientes incrementó la colocalización entre IL-1β y LC3B a las 4hs. p.e., y promovió significativamente la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP a las 5 hs p.e. Dado que la secreción de IL-1β en neutrófilos requiere de la actividad de la NADPH oxidasa, nos planteamos como hipótesis que la actividad de la enzima es necesaria para evitar la acidificación de las vesículas que contienen IL-1β y de esta forma prevenir su degradación por proteasas ácidas lisosomales. En favor de esta posibilidad, el tratamiento de neutrófilos con inhibidores de la NADPH oxidasa como DPI y apocinina inhibió la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP y no modificó los niveles intracitoplasmáticos de la misma, sugiriendo que la IL-1β es degradada si la enzima es inhibida. Por otro lado, en neutrófilos estimulados por 4 hs. con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando parcialmente con gp91 (componente de la NADPH oxidasa). Sin embargo, el tratamiento con DPI de neutrófilos estimulados con LPS+ATP no afectó la colocalización de la IL-1β vesicular con Lysotracker red, aunque disminuyó la colocalización de IL-1β con LC3B. Estos hallazgos indican que la actividad de la NADPH oxidasa es requerida para la secreción de IL-1β pero este efecto parece ser independiente de la acidificación de las vesículas que contienen a la IL-1β. Nuestros resultados no descartan que la NADPH oxidasa sea necesaria en otros pasos del proceso de secreción, como ser en la inducción del proceso autofágico o en la exocitosis de las vesículas autofágicas conteniendo IL-1β. Por último, también determinamos que una porción de la IL-1β sintetizada puede ser degradada por serin proteasas neutras, cuya actividad estaría determinada por el pH vesicular el cuál podría ser modulado por la actividad VATPasa. En conjunto, los hallazgos de este trabajo sugieren que la secreción de IL-1β en neutrófilos podría involucrar un mecanismo de autofagia secretoria y que la cantidad de IL-1β secretada dependería de su resistencia a ser degradada por proteasas antes de ser conducida al medio extracelular. |
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