Estudio del rol de la tetraspanina CD63 en células dendríticas humanas y su participación en la internalización de antígenos
Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido desarrollar un anticuerpo monoclonal (AMC) murino denominado FC-5.01, usando como inmunógeno la línea celular de carcinoma mamario humano indiferenciado IIB-BR-G. Se identificó el antígeno reconocido por FC-5.01 como la Tetraspanina CD63/lamp 3....
Guardado en:
| Autor principal: | |
|---|---|
| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
2005
|
| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3817_Mantegazza http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3817_Mantegazza_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | Trabajos previos de nuestro laboratorio han permitido desarrollar un anticuerpo monoclonal (AMC) murino denominado FC-5.01, usando como inmunógeno la línea celular de carcinoma mamario humano indiferenciado IIB-BR-G. Se identificó el antígeno reconocido por FC-5.01 como la Tetraspanina CD63/lamp 3. La tetraspanina CD63 está presente en la superficie y en endosomas y lisosomas de células de melanoma, células dendríticas (CDs) y macrófagos; también se encuentra en vesículas secretorias, como los cuerpos de Weibel-Palade de células endoteliales, gránulos citolíticos de células T citotóxicas, gránulos α de plaquetas y gránulos de basófilos, neutrófilos y eosinófilos, localizándose en la membrana plasmática luego de la activación de dichas células. Observamos que el AMC FC-5.01 reconoce CDs humanas obtenidas a partir del cultivo de monocitos de sangre periférica en presencia de interleuquina-4 (IL-4) y factor estimulador de coloninas granulocito-monocito (GM-CSF). Demostramos mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal que el complejo de superficie FC-5.01-CD63 se internaliza en CDs, siguiendo el trayecto endosomal-lisosomal, y alcanza los compartimentos enriquecidos en moléculas MHC de clase II (MIICs), donde tiene lugar el procesamiento y cargado de los péptidos a ser presentados en el contexto de las moléculas clase II. Detectamos que las tetraspaninas CD9, CD81, CD82 y CD151 también se expresan en CDs. CD9 y CD81 se localizan predominantemente en la superficie celular, mientras que CD63 y CD82 también se expresan intracelularmente. La incubación con AMCs anti-CD9, CD63, CD81 y CD82 causa un aumento de la migración celular inducida por los quimioatractantes MIP-1α y MIP-5, entre un 50% y un 70%. La incubación con todos los AMCs simultáneamente produce un aumento de casi un 100% en la quimiotaxis celular. Mediante inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, demostramos la asociación entre tetraspaninas y ciertas integrinas. Proponemos que CD63 está involucrado en la captura selectiva de antígenos (Ags) por las CDs. Observamos que la fagocitosis de S. cerevisiae, pero no la endocitosis de FITC-dextrán ni la captura de partículas de látex, produce una disminución en la expresión de superficie de CD63. Visualizamos mediante microscopía que CD63 acompaña la fagocitosis de S. cerevisiae y se localiza en organelas intracelulares conteniendo las levaduras fagocitadas. Mediante inmunoprecipitación detectamos la asociación entre CD63 y el receptor de β-glucanos dectin-1, el cual participa en la captura de levaduras por las CDs. CD63 no parece estar asociado con el receptor de manosa (MR) ni el DC-SIGN, reponsable de la entrada de varios patógenos a las CDs, como el virus del dengue. A partir del hibridoma productor del AMC FC-5.01 construimos una molécula recombinante “single-chain Fv” (scFv), mediante el ensamblado de las porciones variables de la cadena pesada (VH) y la cadena liviana (VL) del AMC por medio de un péptido espaciador. La molécula recombinante scFv-5.01 mantiene la especificidad en el reconocimiento de CD63. El complejo de superficie scFv-5.01-CD63 se internaliza y alcanza los compartimentos MIIC en CDs, al igual que el anticuerpo parental. Partiendo de dicha construcción, generamos una proteína de fusión portando el péptido de melanoma MART-1 (scFv-5.01-MART-1), la cual también mantiene la reactividad del anticuerpo parental contra CD63 y alcanza los compartimentos MIIC al internalizarse en CDs. Por último, conjugamos químicamente el AMC FC-5.01 con una proteína altamente inmunogénica como el toxoide tetánico (TT). Comprobamos que el conjugado FC-5.01-TT retiene la especificidad del anticuerpo parental por CD63, se internaliza en CDs, alcanza los compartimentos MIIC, es presentado por dichas células y genera una respuesta específica de linfocitos autólogos de dadores vacunados contra el tétanos. Por lo todo lo expuesto, consideramos que el AMC FC-5.01 o sus fragmentos derivados podrían ser utilizados como vehículo de péptidos o proteínas antigénicas de interés hacia las CDs, las cuales presentarían dichos Ags y generarían una respuesta inmune específica. Nuestros resultados aportaron también nueva evidencia acerca del posible rol de CD63 y otras tetraspaninas en CDs. |
|---|