Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display
Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecularpara detectar diferentes niveles de transcripción en distintosestadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Esteensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de l...
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| Autor principal: | |
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| Otros Autores: | |
| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
1999
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n3114_DiazAnel http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n3114_DiazAnel_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecularpara detectar diferentes niveles de transcripción en distintosestadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Esteensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARNmensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, endiferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandascaracterístico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones secorren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observanpor autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadioscelulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren unaamplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARNmensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) delparásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas,se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellasaplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener unatranscripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotesmetacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en elbacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que,una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió unahomología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de lasproteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructurasde ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesoscomo transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicingy editing.Además se ha descripto su participación en diferenciacióny desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importantecon en el estudio de la participación de estas proteinas en losprocesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferenciade la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gende esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de laproteína mostraron que este gen se encuentra representado en porlo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró queesta ARN helicasa posee una especificidad enzimática condirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con unaaparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunosmiembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencialentre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y lacaracterización parcial de su función enzimática, son el principiopara estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad deeste parásito y nos permitirá conocer un poco más de este procesodel cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de laenfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos elhombre. |
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