Canales de calcio y liberación del neurotransmisor en sinapsis normales y en regeneración de la placa neuromuscular de vertebrados
El Ca²+ es un eslabón clave entre la llegada del potencial de acción al terminal sináptico y laliberación del neurotransmisor (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). El rápido incremento en [Ca²+]ext que ocurre ante la despolarización de la membrana terminal es el resultado de laapert...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis doctoral publishedVersion |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
1997
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | https://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n2909_Katz http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=aextesis&d=tesis_n2909_Katz_oai |
| Aporte de: |
| Sumario: | El Ca²+ es un eslabón clave entre la llegada del potencial de acción al terminal sináptico y laliberación del neurotransmisor (Katz, 1969; Katz & Miledi, 1970). El rápido incremento en [Ca²+]ext que ocurre ante la despolarización de la membrana terminal es el resultado de laapertura de canales de Ca²+ dependientes de voltaje (CCVD) que permiten la entrada de Ca²+desde el medio extracelular (Llinás y col., 1976; Augustine & Charlton, 1986). Basándose ensus características biofísicas y farmacológicas se han descripto varias clases de CCVD, loscuales han sido clasificados en los tipos T, L, N y P (Bean 1989; Llinás y col., 1992; Olivera ycol., l994; Dunlap y col., 1995). Más recientemente han sido descriptos los canales de tipo Q,un tipo de canal estrechamente relacionado con los de tipo P, y los canales tipo R, los cualesson resistentes a cualquiera de las drogas y toxinas antagonistas de los otros tipos de CCVD (Zhang y col., l993; Randall & Tsien, l995). Se ha mostrado que varios de estos CCVD,particularmente los de tipo N, L, P y Q, están involucrados en la liberación delneurotransmisor en diferentes sinapsis (ver Olivera y col., 1994; Dunlap y col., 1995). En Ia placa neuromuscular madura del ratón, la transmisión sináptíca es mediada por laentrada de Ca²+ a través de canales de tipo P (y/o Q) (Uchitel y col, l992; Protti & Uchitel, 1993; Bowersox y col., 1995; Hong & Chang, 1995; Wright & Angus, 1996). En estapreparación se ha demostrado que la w-AgaIVA, un bloqueante de CCVD de tipo P y Q,ejerce un fuerte efecto inhibitorio sobre la liberación de [³H]ACh (Wessler y col., 1995), lascorrientes presinápticas de Ca²+ y sobre la liberación evocada neuralmente y por alto K+ (Protti & Uchitel, l993, Hong & Chang, 1995; Bowersox y col., 1995; Wright & Angus, 1996). En vista de la falta de efectos de la (w-CgTx (Sano y col., 1987, Protti y col., 1991; Bowersox y col., 1995) y las DHPs (Atchinson, 1989), se piensa que los canales de tipo N y Lno tienen una participación significativa en el proceso de liberación en condiciones normales. En la placa neuromuscular de la rana, se demostró que la w-CgTx ejerce un fuerte efectoantagónico sobre la liberación (Kerr & Yoshikami, 1984; Sano y col., 1987; Koyano y col., 1987) mientras que los antagonistas de los canales de tipo L resultan ineficaces (Sano y col., 1987). Se ha demostrado también que los sitios de unión de la w-CgTx están co-localizadoscon las zonas activas de liberación dela presinapsis enfrentados justo a los sitios de unión dela α-bungarotoxina en la postsinapsis (Robitaille y col., 1990; Cohen y col., 1991). Estasevidencias indican que los canales de tipo N se hallan involucrados en el proceso deliberación en este sistema. Durante el curso de la maduración de la unión neuromuscular devertebrados, se han reportado cambios en la farmacología de los CCVD acoplados al procesode liberación en aves (Gray y col., l992) y anfibios (Fu & Huang, 1994). Se desconoce, sinembargo, la farmacología de los canales de Ca²+ acoplados al proceso de liberación en lassinapsis recientemente formadas de la unión neuromuscular de mamíferos. Objetivos El propósito de este estudio fue evaluar por medio de técnicas electrofisiológicas yfarmacológicas que tipos de CCVD están involucrados en la liberación del neurotransmisoren la placa neuromuscular normal de mamíferos (ratón) y anfibios (rana) y correlacionar elperfil farmacológico del proceso de liberación con el de las corrientes presinápticas de calcioy de potasio activada por calcio, Ica, y Ikca, respectivamente. Otro objetivo del presente trabajofue evaluar si se producen cambios en los CCVD acoplados al proceso de liberación durantela reinervación de la placa neuromuscular. Métodos Para estudiar la placa neuromuscular normal del ratón, los experimentos se llevaron a cabo enel músculo diafragma o en el levator auris longus de ratones macho adultos de la cepa Swissde 20-30 g de peso corporal. Para estudiar las placas del ratón durante la regeneración, seutilizaron ratones adultos a los cuales se les había provocado un daño “crush” a la ramaauricular posterior del nervio facial que inerva al levator auris izquierdo. Los animales controly los desnervados en diferentes etapas luego de la restauración de la transmisión sinápticafueron anestesiados e inmediatamente desangrados. Par estudiar la placa neuromuscular de larana los experimentos se realizaron en el músculo cutaneous pectoris de Rana caluesbiana de 40-60 g de peso corporal. Las ranas fueron matadas por doble punción (medular-cerebral). Elmúsculo correspondiente, junto con el nervio motor que lo inerva, fue removido y luegodisecado en una caja de Petri con base de Sylgard conteniendo la solución de Ringer normaladecuada para cada preparación. Para ratón, (en mM): NaCl, l37; KCl, 5; CaCl2, 2; MgSO4, 1; NaHCO3, 12; Na2HPO4, 1; glucosa, 11, continuamente burbujeados con 95% O2/5% CO2. Para rana, (en mM): NaCl, ll5; KCl, 2; CaCl2, l.8; MgCl2, 1 y HEPES, 5; pH 7.3. Lapreparación fue luego transferida a la cámara de registros a la cual se le suministró lasdistintas soluciones de trabajo. Los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente (19-23 °C), excepto en algunos casos en los cuales se varió la temperatura de la cámara deregistros. la misma fue controlada (i l °C) por medio de dispositivos termoeléctricos Peltier. Los potenciales de placa evocados (EPPs) y espontáneos (MEPPs) fueron registradosintracelularmente con microelectrodos de vidrio convencionales llenados con KCl 3M (resistencia 10-20 MΩ). El contenido cuántico de la respuesta evocada en solución de Ringernormal se evaluó por el método de la varianza (Martin, 1966). La contracción muscular fuesuprimida por medio de d-tubocurarina. Luego de impalar una fibra muscular, el nervio fueestimulado, mediante un electrodo de succión, en forma continua durante 1 min a 0.5 Hz yluego se registraron 50-100 EPPs sucesivos. En las solución de bajo Ca²+-alto Mg²+, elcontenido cuántico se evaluó por el método directo o por el método de las fallas (Martin, 1966). Las corrientes presinápticas se registraron mediante microelectrodos de vidrio llenadoscon NaCl 2M (resistencia 5-15 MΩ) insertados, bajo control visual, en la vaina perineural delas ramas finas del nervio (Mallart, l985a). Los músculos fueron incubados en solución de Ringer normal en presencia d-tubocurarina 30-50 μM. La Ica y la Ik(ca) se obtuvieronmediante el agregado de bloqueantes de los canales de potasio. Para discriminar los distintos tipos de canales de Ca²+ presentes en estos terminales motoresse utilizaron las siguientes drogas y toxinas: Nitrendipina, una dihidropiridina antagonista delos CCVD de tipo L. FTX, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aperta,bloqueante de los CCVD de tipo P w-AgaIVA, toxina derivada del veneno de la araña Agelenopsis aparta, bloqueante de los CCVD de tipo P y Q. w-CgTx, toxina derivada delveneno del caracol marino Conus geographus bloqueante de los CCVD de tipo N. w-MVIIDy w-MVIIC toxinas derivadas del veneno del caracol marino Conus magus, bloqueantes de loscanales de tipo N, P y Q. Resultados Placa Neuromuscular Normal del Ratón La w-AgaIVA (l00 nM) y las omega conotoxinas w-MVIIC (1 μM) y w-MVIID (3 μM),antagonizaron fuertemente la liberación del neurotransmisor (> 80-90% de bloqueo). La w-CgTx (5 μM) y la nitrendipina (10-20 μM) no resultaron efectivas. La liberación fue más sensible a la acción de la w-MVIIC (IC50 = 39 nM) que a la w-MVIID (le0 = 1.37 pM). Luego de bloquear la liberación casi completamente (contenido cuántico ~ 0.3% de su valor control) con w-MVIIC 3 μM, elevar la [Ca²+]ext de 2 a lO mM causó unincremento de ~2Ox, tanto en el contenido cuántico estimado como en la amplitud del EPP. La liberación evocada en solución de bajo Ca²+-alto Mg²+ (baja probabilidad de liberación,contenido cuántico = 2.02 ± 0.08) y la liberación evocada en Ringer normal (contenidocuántico = 90.5 ± 3.7) presentaron la misma sensibilidad a la acción de la w-AgaIVA (IC50= 16.8 nM y 14.4 nM, respectivamente) Tanto la Ica como la Ikca, resultaron altamente sensibles a bajas dosis de w-AgaIVA (10-30nM). Estas corrientes presinápticas fueron también fuertemente antagonizadas por la w-MVIIC (1 μM). Placa Neuromuscular Normal de la Rana La liberación evocada fue bloqueada por la FTX (IC50 = 0.02 μl/ml) y por la w-CgTx (1 μM)pero no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La FTX (0.1 μl/ml) causó un incremento de ~2x en la frecuencia de MEPPs tanto en la solución de Ringer normal como en la de bajo Ca²+/alto Mg²+ y no afectó la amplitud de los MEPPs en ninguna de las dos condiciones. La Ica fue bloqueada completamente por la w-CgTx (5 μM), parcialmente bloqueada por la FTX (l μl/ml) y no fue afectada por la w-AgaIVA (0.5 μM). La Ikca resultó fuertemente antagonizada por la caribdotoxina (300 nM), bloqueante de loscanales de K+ activados por Ca²+, y completamente suprimida por BaCl2 (200 μM). Estacorriente fue también bloqueada por la w-CgTx (5 μM) y por CdCl2 (200 μM) pero no fueafectada por la FTX (1 μl/ml). El bloqueo ejercido por la w-CgTx no pudo ser revertido por elaumento del [Ca²+]ext a 10 mM. Placa Neuromuscular de Ratón en Regeneración La liberación evocada neuralmente fue bloqueada por la w-AgaIVA, (30 y 100 nM causaron ~50 y 90% de inhibición, respectivamente). La w-CgTx (1 y 5 μM), como ocurre en las placasnormales, no afectó significativamente este tipo de liberación durante la reinervación. Lanitrendipina (1-10 μM), antagonizó fuertemente la liberación (~40-6 Consulte el resumen completo en el documento. |
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