Desarrollo de un sistema CRISPR Cas I F1 para el silenciamiento y edición de genes de resistencia a antimicrobianos y relacionados a la virulencia en bacterias

Fil: Molina, María Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal: Molina, María Carolina
Otros Autores: Power, Pablo
Formato: Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:Español
Publicado: Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica 2024
Materias:
Acceso en línea:http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_7881
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spelling I28-R145-HWA_78812025-11-06 Fil: Molina, María Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina Power, Pablo Quiroga, Cecilia Molina, María Carolina 2024-04-15 A medida que las infecciones bacterianas crecen como un problema para la medicina moderna, debido a la emergencia y diseminación de patógenos bacterianos con mecanismos de resistencia antibiótica, también denominados multidroga resistentes (MDR), aumenta la necesidad de contar con herramientas que puedan mejorar nuestra habilidad para combatir patógenos emergentes, así como también, descifrar sus mecanismos de resistencia y patogenicidad. La habilidad de manipular genéticamente los microorganismos ha permitido profundizar el conocimiento en múltiples campos de la biología, así como también, ha abierto las puertas al desarrollo de distintas herramientas terapéuticas. En particular, las tecnologías CRISPR-Cas se han destacado frente a otras preexistentes debido a la simplicidad asociada a su programación. En este trabajo, nos propusimos analizar la estructura genética, expresión y funcionalidad del sistema CRISPR-Cas de tipo I-F1 de la cepa de origen clínico Shewanella xiamenensis Sh95 (Sh95 I-F1CRISPR-Cas). Por otro lado, estudiamos su reprogramabilidad endógena y la transferencia de su maquinaria a cepas bacterianas modelo empleando una amplia gama de aproximaciones metodológicas. Por último, evaluamos su posible aplicación en bacterias no modelo contra genes de resistencia a antibióticos y asociados a la virulencia. Nuestros resultados demostraron que este sistema está transcripcionalmente activo con una expresión de tipo constitutiva y policistrónica. También revelaron la presencia de regiones de inserción, la existencia de transcripción en el anti-sentido a los genes cas y evidenciaron la presencia de secuencias promotoras intra-génicas en cas2/3. A continuación, estudiamos la reprogramación endógena en su contexto nativo mediante la introducción de guías en trans, en forma de mini arreglos CRISPR sintéticos específicos para este sistema. Los resultados obtenidos demuestran que este sistema se encuentra funcionalmente activo en S. xiamenensis Sh95 y que es posible redireccionar la maquinaria Sh95 I-F1CRISPR-Cas hacia genes específicos presentes en plásmidos. Estos resultados nos llevaron a estudiar la transferencia de este sistema a E. coli modelo mediante plásmidos recombinantes y mini arreglos CRISPR sintéticos que codifican la maquinaria Sh95 I-F1CRISPR-Cas reprogramable. En este sentido, nuestros resultados establecieron que fue posible transferir y reprogramar este sistema en E. coli donde observamos la interferencia en la transformación y edición del plásmido blanco. Además, al caracterizar las colonias supervivientes encontramos distintos eventos de edición sobre el plásmido blanco y mostramos la primera evidencia de recuperación de plásmidos blanco modificados con inserciones y deleciones. En el último capítulo de esta tesis mostramos los resultados del primer abordaje a la posible aplicación de Sh95 I-F1CRISPR-Cas como herramienta contra la RAM y la virulencia bacteriana, evaluando su efecto sobre genes presentes en plásmidos y en cromosoma, respectivamente. En el primer caso, los resultados obtenidos contra el gen blaTEM sugiere que empleando una única guía ARN CRISPR es posible interferir con la transformación del plásmido blanco en bacterias modelo. Sin embargo, para su aplicación en bacterias MDR prevemos la necesidad de optimizar el mecanismo de entrega de la maquinaria Sh95 I-F1CRISPR-Cas. Con respecto a la reprogramación hacia el gen csgD, que codifica el regulador maestro de la formación de biofilm, Sh95 I-F1CRISPR-Cas produjo efectos bactericidas sobre distintas cepas de E. coli; mientras que, en el aislamiento clínico S. enterica CQ29 permitió la recuperación de mutantes fenotípicas. En general, los resultados aquí plasmados demuestran la potencialidad de Sh95 I-F1CRISPR-Cas como herramienta de manipulación genética y constituyen las bases de su futura aplicación en el control de la RAM y la virulencia. application/pdf Gutkind, Gabriel Cerquetti, María Cristina Mutto, Adrián Angel CRISPR-Cas Edición genética Resistencia antimicrobiana Virulencia bacteriana spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas Desarrollo de un sistema CRISPR Cas I F1 para el silenciamiento y edición de genes de resistencia a antimicrobianos y relacionados a la virulencia en bacterias info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_7881 https://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_7881.dir/7881.PDF