Caracterización del Factor de Elongación 2 de Trypanosoma cruzy

Fil: Simonetti, Leandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina

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Detalles Bibliográficos
Autor principal:	Simonetti, Leandro
Otros Autores:	Longhi, Silvia
Formato:	Tesis doctoral acceptedVersion
Lenguaje:	Español
Publicado:	Facultad de Farmacia y Bioquímica 2017
Materias:	Trypanosoma cruzi EF2 Modelado molecular Complementación de levaduras Traducción in vitro Ciencias de la vida
Acceso en línea:	http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_2826 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_2826.dir/2826.PDF
Aporte de:	Repositorio Digital de la Universidad de Buenos Aires (UBA) de Universidad de Buenos Aires

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Estas\ndiferencias sugieren que la síntesis de proteínas podría también presentar características únicas; sin\nembargo el proceso de traducción en tripanosomátidos no ha sido estudiado en profundidad.\nEn trabajos previos del laboratorio demostramos que los ribosomas de tripanosomátidos son\nresistentes a tricosantina, una toxina proteica que inhibe la actividad de ribosomas eucariotas.\nAdemás construimos un mapa de densidades electrónicas del ribosoma 80S de T. cruzi, donde se\nobservaron características estructurales distintivas no encontradas en otros eucariotas. También\nencontramos particularidades en las secuencias y en los patrones de interacción de las proteínas que\nconforman el tallo ribosomal de T. cruzi, un complejo pentamérico esencial para la síntesis proteica\nya que, junto con otras proteínas ribosomales y ARNr, median la interacción de distintos factores de\ntraducción con el ribosoma, y controlan la actividad GTPasa de algunos de estos, entre ellos el\nFactor de Elongación 2 (EF2), responsable de la translocación del ribosoma durante la fase de\nelongación. Continuando con esta línea de trabajos es que decidimos abordar la caracterización del\nEF2 de T. cruzi (TcEF2).\nDebido a que existe una gran variabilidad genética dentro de la especie T. cruzi, esta ha sido subdividida\nen seis Unidades Discretas de Tipificación (UDT I-VI). Para evaluar la diversidad del\nTcEF2 en las distintas UDT, diseñamos primers a partir de las secuencias disponibles de la cepa CL\nBrener (UDT VI) y clonamos y secuenciamos el gen a partir de cepas pertenecientes a las demás\nUDT. A nivel de secuencias de ADN, si bien observamos una identidad mayor al 99% entre todas\nlas UDT, encontramos 35 variaciones. De estas, 29 corresponden a transiciones y sólo 7 a\ntransversiones únicamente de dos tipos (G?T y G?C). El 80% de las variantes afectan la tercera\nposición de los codones y no producen cambios en la secuencia aminoacídica, mientras que las\nrestantes generan 6 cambios no-sinónimos. En reconstrucciones filogenéticas, las UDT I y II forman\nlíneas independientes, mientras que las UDT III y IV, y las UDT V y VI, forman parte de sendos\nclados, acorde a los estudios existentes sobre la filogenia de T. cruzi.\nConstruimos un modelo de la estructura proteica del TcEF2 unida a GDP e ión Magnesio,\nbasándonos en el cristal de su ortólogo en Saccharomyces cerevisiae, con el que comparte una\nidentidad en su secuencia aminoacídica del 57,6%. En el modelo observamos los seis sub-dominios\nclásicos de los EF2 eucariotas, así como la conservación de diversos residuos con importancia\nfuncional: las cuatro hélices canónicas que forman el bolsillo GTPasa están conservadas, los\naminoácidos que estabilizan el GDP y el ión Magnesio, la Histidina que es diftamidada posttraduccionalmente\n(His703), una de las dos Treoninas fosforilables (Thr57), las dos Lisinas (Lys511 y Lys617), y 8 de las 11 Argininas metilables. Este modelo se utilizó además para simular el efecto\nde las variaciones observadas en las distintas UDT, sobre su estabilidad estructural. Los resultados\nmostraron un aumento en la estabilidad de todos los TcEF2, excepto para las UDT III y IV en donde\nuna Alanina en la posición 360 presenta un efecto altamente desestabilizante, si bien este efecto es\ndisminuido gracias a la introducción de otra Alanina, en posición 367.\nPara estudiar la similitud a nivel funcional entre el TcEF2 y otros EF2, realizamos ensayos de\ncomplementación en levaduras, utilizando la cepa de S. cerevisiae GB2, la cual es knock-out para el\nEF2 y contiene una copia del factor endógeno bajo un promotor inducible por galactosa. Además de\nutilizar el EF2 de S. cerevisiae (ScEF2) como control positivo, clonamos el factor de Mus musculus\n(MmEF2), como representante de un organismo mamífero. Al estudiar la velocidad de crecimiento\nde cultivos de levaduras en condiciones de co-expresión del TcEF2 con ScEF2, observamos una\naumento en los tiempos de duplicación, sugiriendo una posible inhibición competitiva. En los\nensayos de complementación realizados, ni el TcEF2 ni el MmEF2, rescataron el crecimiento en la\ncepa GB2. Sin embargo, no fue posible concluir ningún efecto del TcEF2, ya que al analizar los\nniveles de expresión por Western Blot, encontramos que los factores heterólogos eran producidos en\ncantidades menores comparados con el factor endógeno.\nPara salvar este obstáculo, utilizamos un sistema de complementación in vitro donde, el TcEF2\nrescató la traducción en polisomas de T. cruzi y de Rattus norvegicus. El TcEF2 tiene una similitud\na nivel de amioácidos del 75%, con R. norvegicus, M. musculus y Homo sapiens, sin embargo, los\nresiduos que contactan con los distintos componentes del ribosoma presentan una similitud del\n83%. Por su parte, los residuos de las proteínas ribosomales (L9, L12, S23, S30 y P0) que contactan\nel EF2, presentan una similitud del 96,1%, y los ARNr (28S y 18S), una identidad del 88,2%, entre\nlas de T. cruzi y las de los mamíferos estudiados.\nNuestros resultados sugieren que, pese a las diferencias entre los EF2 de T. cruzi y mamíferos, el\nTcEF2 podría reemplazar funcionalmente al factor de mamíferos, probablemente debido a la alta\nconservación de los residuos que participan formando puentes de Hidrógeno y enlaces hidrofóbicos\nentre el EF2 y el ribosoma. application/pdf González Flecha, Luis Carrillo, Carolina Zago, María Paola Trypanosoma cruzi EF2 Modelado molecular Complementación de levaduras Traducción in vitro spa Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica info:eu-repo/semantics/openAccess http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ar/ Ciencias de la vida Caracterización del Factor de Elongación 2 de Trypanosoma cruzy info:eu-repo/semantics/doctoralThesis info:ar-repo/semantics/tesis doctoral info:eu-repo/semantics/acceptedVersion http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/cgi-bin/library.cgi?a=d&c=posgraafa&cl=CL1&d=HWA_2826 http://repositoriouba.sisbi.uba.ar/gsdl/collect/posgraafa/index/assoc/HWA_2826.dir/2826.PDF

Caracterización del Factor de Elongación 2 de Trypanosoma cruzy

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