Caracterización de la transferencia de magnetización para detectar proteínas GFP con imágenes no invasivas de resonancia magnética nuclear
La identificación de biomarcadores específicos de tipos celulares o de enfermedades es de gran importancia para el desarrollo de nuevas tecnologías médicas que permitan su identificación de manera no invasiva. La proteína verde fluorescente (GFP) es ampliamente utilizada en sistemas biológicos...
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| Autor principal: | |
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| Formato: | Tesis NonPeerReviewed |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2021
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| Materias: | |
| Acceso en línea: | http://ricabib.cab.cnea.gov.ar/944/1/1Kortsarz.pdf |
| Aporte de: |
| Sumario: | La identificación de biomarcadores específicos de tipos celulares o de enfermedades
es de gran importancia para el desarrollo de nuevas tecnologías médicas que permitan
su identificación de manera no invasiva. La proteína verde
fluorescente (GFP) es ampliamente
utilizada en sistemas biológicos ya que es una herramienta
flexible para su
expresión en tipos celulares precisos. Dicha proteína permite localizar de forma controlada
zonas de interés anatómicas y funcionales en tejidos a través de microscopía
óptica ex vivo. Sin embargo, su gran precisión es a costa de tener que ser observada a
través de técnicas invasivas que sacrifican al animal de estudio.
En esta tesis evaluamos la capacidad de detectar la GFP basándonos en sus propiedades
químicas y físicas, permitiéndonos observarla de forma no invasiva por imágenes por
resonancia magnética nuclear (MRI). Particularmente, implementamos y optimizamos
la técnica de MRI llamada imágenes por transferencia de magnetización (MTI) para
detectar la GFP en muestras in vitro y tejidos ex vivo. MTI es una técnica de MRI
diseñada para observar las macromoléculas presentes en los tejidos de forma no invasiva.
Tópicamente, las macromoléculas no pueden ser detectadas directamente mediante MRI
usual, a causa de los cortos tiempos de vida media de la señal de MRI. En cambio,
mediante MTI, es posible detectarlas indirectamente a través del medio líquido que
las rodea. En MRI convencional las diferencias en el brillo de las imágenes vienen
dadas, normalmente, por la cantidad de protones o por las diferencias en los tiempos
de relajación. En contraste a esto, en el caso de MTI, la señal adquirida refleja el
intercambio de protones entre las moléculas de agua y las macromoléculas.
En este trabajo exploramos cuáles son los parámetros óptimos que nos permiten maximizar
el contraste en MTI, inducido por la proteína GFP in vitro y ex vivo. Comparamos
estos efectos con los inducidos por la proteína llamada albúmina de suero
bovino (BSA). La albúmina es la principal proteína de la sangre y, a su vez, una de
las más abundantes en el ser humano. Esto nos permitiría predecir la factibilidad para
distinguir la señal inducida por la GFP de la inducida por otras macromoléculas que
se hallan intrínsecamente presentes en tejidos. Observamos que los efectos de la GFP,
reflejados en la señal, son significativamente mayores a los de la BSA. A partir de estos
resultados muy prometedores, evaluamos la potencialidad de la técnica implementada
para dos modelos ex vivo diferentes: cerebros de ratón inyectados con un virus que
induce la expresión de GFP en la región del giro dentado del hipocampo y peces cebra
con expresión de GFP en todo su cuerpo.
Mediante experimentos de MTI y microscopia óptica determinamos que los ensayos
realizados para detectar la proteína GFP en el giro dentado del hipocampo de cerebro
de ratón no fueron exitosos. Esto se debió a problemas en el sitio de inyección y los
reducidos niveles de expresión de la proteína GFP. Sin embargo, hemos podido determinar
condiciones y protocolos de trabajo para repetir estas experiencias en un futuro
cercano. Los ensayos con peces cebra transgénicos, los cuales expresan la proteína GFP
de manera ubicua, demostraron la factibilidad de la técnica para detectar de manera
estadísticamente significativa la proteína GFP. Estos ensayos nos permitieron estimar
las regiones de interés mínimas para las cuales se puede diferenciar la presencia de la
proteína GFP de animales control.
Los resultados de este trabajo, en conjunto, nos permitieron comprender la variabilidad
y capacidad intrínseca del método de detección. Esto es esencial para la planificación de
futuros experimentos en función de la pregunta a responder. Los resultados evidencian
que si bien es necesario aumentar la cantidad de muestras analizadas en el presente
trabajo, se puede concluir que la técnica de MTI puede ser de gran utilidad para la
detección de GFP en distintos modelos animales donde se registre una alta expresión
de la proteína GFP o donde se puedan analizar grandes volúmenes de tejido (mayores a
0.2 mm"3). En particular, esta técnica sería de gran utilidad para el estudio de modelos
animales de gran tamaño, como ser ratas y monos. |
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