Impacto del estrés reticular y de la respuesta a proteínas mal plegadas en la función inmune-decidual
La implantación embrionaria implica la generación de una respuesta inflamatoria asociada a la ruptura del epitelio uterino, invasión del endometrio y remodelación de los vasos maternos para soportar la demanda de oxígeno. Dicha respuesta inflamatoria se caracteriza por ser estéril y podría inducirse...
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| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
| Publicado: |
2022
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| Sumario: | La implantación embrionaria implica la generación de una respuesta inflamatoria asociada a la ruptura del epitelio uterino, invasión del endometrio y remodelación de los vasos maternos para soportar la demanda de oxígeno. Dicha respuesta inflamatoria se caracteriza por ser estéril y podría inducirse por ligandos endógenos liberados durante la remodelación tisular que caracteriza a la generación de la interfase materno-placentaria. Para ello el endometrio se reprograma cíclicamente y este proceso se conoce como decidualización. El mismo no solo implica cambios fenotípicos y morfológicos de las células estromales, sino también cambios en su secretoma que se encuentran asociados con la expansión de su retículo endoplásmico, una respuesta fisiológica conocida como estrés reticular (ER) y de respuesta a proteínas mal plegadas (UPR, del inglés unfolded protein response). De este modo, las células decidualizadas secretan factores inmunomoduladores que contribuirán con la implantación embrionaria y condicionarán la respuesta inmune materna. Entre ellos, expresan y secretan el péptido intestinal vasoactivo (VIP) un regulador maestro de la interfase materno-placentaria. A nivel local, VIP induce la decidualización con un pico de expresión al segundo día en células estromales. El objetivo de la presente tesis es investigar el impacto del ER y de la UPR en la función de células deciduales tanto en la inducción de una respuesta inflamatoria estéril fisiológica como la de una de tipo tolerogénica en el periodo peri-implantacional. Asimismo, abordamos la regulación de estos procesos a través de microRNAs (miRNAs) y cómo alteraciones en los mismos llevan a fallas reproductivas tempranas condicionando la implantación embrionaria. En primer lugar, utilizamos un modelo in vitro de decidualización de la línea celular HESC (Human Endometrial Stromal Cells). Evidenciamos que las células decidualizadas aumentaron los niveles de expresión de los sensores de ER y marcadores de UPR. Este aumento se acompaña de un incremento en la expresión de NLRP3, componente del inflamasoma y de la activación de la Caspasa-1 asociada con un aumento en la producción de IL-1β. Más aún, el tratamiento con un inhibidor de la vía de IRE1α, uno de los sensores de ER, previene el índice de adhesión/expansión en las células decidualizadas en un modelo de implantación in vitro, indicando que cierto umbral de ER y UPR son necesarios para la implantación embrionaria. Los presentes resultados fueron validados en muestras de endometrio de pacientes con fallas reproductivas tempranas, pacientes con pérdidas recurrentes del embarazo (RPL) y con fallas reiteradas en la implantación in vitro (RIF). Ambos grupos de pacientes mostraron una expresión diferencial de los niveles de ER/UPR en comparación con las muestras de mujeres fértiles. Asimismo, cuando las células HESC se decidualizaron en presencia de VIP, se observó un aumento en la vía correspondiente alsensor ATF6α y en los marcadores UPR, acompañados por un aumento en la producción IL-1β. Al utilizar un inhibidor de ATF6α (AEBSF) se previno este aumento, lo que indica que la contribución de la vía ATF6α está asociada con la producción de IL-1β en la inducción de la respuesta inflamatoria estéril. Teniendo en cuenta que las vías de UPR están conectadas con la angiogénesis evaluamos el balance entre los factores pro y anti-angiogénicos. Demostramos que las células decidualizadas con VIP favorecen la angiogénesis mediante una disminución de trombospondina-1 y a su vez, estimularon la formación de túbulos de células endoteliales. Más aun, la expresión de los receptores ATF6α y VIP fue reducida en biopsias de endometrio de mujeres con RIF en comparación con la observada en mujeres fértiles. Seguidamente nos enfocamos en la homeostasis del programa de decidualización y particularmente estudiamos la inducción de células DC-10, un perfil tolerogénico de células dendríticas. Observamos que los factores solubles producidos por las células decidualizadas fueron capaces de inhibir la diferenciación de monocitos hacia un perfil clásico de células dendríticas inmaduras. Más aún, fueron capaces de promover la expresión de marcadores tolerogénicos característicos como la molécula HLA-G y su receptor ILT-2. También demostramos que las células estromales estresadas pueden transmitir el ER, induciendo un perfil pro-inflamatorio. Finalmente, estudiamos el perfil de miRNAs asociados a la regulación del ER/UPR en células estromales endometriales. Primero identificamos a través de un análisis in silico potenciales miRNAs involucrados en este proceso utilizando la base de datos miRNet. Los resultados obtenidos fueron validados en un modelo ex vivo y evidenciamos que los miR-17-5p, miR-21-5p y miR-193b-3p se regulan negativamente en células endometriales estresadas. A su vez, se analizó la presencia y localización de estos miRNAs en muestras de endometrio de pacientes con RIF y con RPL mediante hibridación in situ con sondas marcadas complementarias al miRNAs específico. Por primera vez, no solo identificamos 3 miRNAs involucrados en la regulación del proceso de decidualización, sino que identificamos su expresión diferencial en el epitelio glandular y estroma endometrial de pacientes con fallas reproductivas. Los presentes resultados sustentan que el programa de decidualización comprende la inducción de ER y UPR que conlleva a la secreción de IL-1β generando una respuesta inflamatoria estéril. A su vez, la decidualización mediada por VIP privilegia la vía de ATF6α asociada con una respuesta inflamatoria y angiogénesis que podría condicionar la receptividad endometrial. Más aun, las células decidualizadas, mediante la producción de factores solubles, inducen la diferenciación de las DC-10, las cuales tienen la capacidad de promover la tolerancia a través de la secreción de IL-10. A su vez, las células estromales estresadas tienen la capacidad de transmitir dicho estrés a las células dendríticas. Por último, los miR-17-5p, miR-21-5p, y miR-193b-3p asociados a ER/UPR pueden modularse en las células decidualizadas. Alteraciones en estos procesos se asocian a patologías tempranas como evidenciamos en muestras endometriales de pacientes con RPL y RIF. Embryo implantation involves the generation of an inflammatory response associated with the rupture of the uterine epithelium, invasion of the endometrium and remodeling of the maternal vessels to support oxygen demand. This inflammatory response is sterile and could be induced by endogenous damage ligands released during tissue remodeling; that characterizes the generation of the maternal-placental interface. In this way, the endometrium is cyclically reprogrammed, and this process is known as decidualization. The decidualization program is essential for placental formation and involves not only morphological alterations of the endometrial stromal cells, but it also involves changes in their secretome associated with the expansion of the endoplasmic reticulum, a physiological response called reticular stress (RS) and unfolded protein response (UPR). Hence, decidualized cells secrete immunomodulatory factors that will contribute to embryo implantation and will condition the maternal immune response. In this context, decidual cells express and secrete the vasoactive intestinal peptide (VIP), a master regulator of the maternal-placental interface. At local level, VIP induces decidualization in stromal cells with a peak of expression at day 2. The present work aims to study the impact of the ER stress and the UPR on the function of decidual cells both in inducing a physiological sterile inflammatory response and in a tolerogenic one during the peri-implantation period. We will address the regulation of these processes through microRNAs (miRNAs) and how alterations in them lead to early reproductive failures, conditioning embryo implantation. We use the HESC cell line (human endometrial stromal cell) as model of in vitro decidualization. After decidualization treatment increased the expression of RS-sensors and UPR markers. This increase is accompanied by an increased NLPR3 expression, and an active Caspase-1 associated and IL-1β production. Moreover, the treatment with STF-083010, an inhibitor of IRE1α pathway, decreased the expansion index observed in decidualized cells, evaluated by an in vitro model of implantation, suggesting that this process is at least partially dependent of the RS/UPR response. The present results were validated in endometrial samples from patients with early reproductive failure, patients with recurrent pregnancy loss (RPL) and with repeated in vitro implantation failure (RIF). Both groups of patients showed a differential expression of ER/UPR levels compared to samples from fertile women. In HESC cells decidualized with VIP we observed an increased expression of ATF6α, an ER stress-sensor, and UPR markers, associated with an increase of IL-1β production. Moreover, AEBSF (ATF6α -inhibitor pathway) prevented this effect, indicating that the contribution of the ATF6α pathway is associated with the production of IL-1β through induction of the sterile inflammatory response. Considering that UPR pathways have been related to the angiogenesis process, we evaluated the balance between pro- and anti-angiogenic factors. We showed that VIP- decidualized cells favors angiogenesis accompanied by a strong downregulation in thrombospondin-1 and stimulated the formation of endothelial cell tubules. Furthermore, the expression of ATF6α and VIP receptors were reduced in endometrial biopsies from women with RIF in comparison with fertile. Next, we focus on the homeostasis of the decidualization program and particularly in the induction of a tolerogenic profile of dendritic cells, in the DC-10 subset. We observed that the soluble factors produced by the decidualized cells were able to inhibit the differentiation of monocytes towards a classic profile of immature dendritic cells. Furthermore, they were able to promote the expression of tolerogenic markers characteristic of DC-10 in monocyte-derived cells, such as the HLA-G molecule and its receptor, ILT-2. Also, we demonstrated that stressed stromal cells can inhibit the monocyte-derived cell differentiation, induce a pro-inflammatory profile and transmit ER. Finally, we studied the miRNAs profile associated with ER/UPR regulation in endometrial stromal cells. First, we identified through an in silico analysis potential miRNAs involved in this process using the miRNet database. The results obtained were validated in an ex vivo model and we showed that miR-17-5p, mir-21-5p and miR-193b-3p are negatively regulated in stressed endometrial cells. Also, the presence and localization of these miRNAs in endometrial samples from patients with RIF and RPL were analyzed by in situ hybridization with labelled probes complementary to the specific miRNA. Thus, for the first time, we not only identified these 3 miRNAs in the regulation of the decidualization process, but also identified their differential expression in the glandular epithelium and endometrial stroma of patients with reproductive failure. Together, these results show that the decidualization program involves RS and UPR induction leading to IL-1β secretion, generating a sterile inflammatory response. Also, VIP, a master regulator, favors the ATF6α pathway associated with an inflammatory response and angiogenesis that might condition endometrial receptivity. Furthermore, decidualized cells, through the production of soluble factors, induce the differentiation of DC-10, which have the ability to promote tolerance through IL-10 secretion. Also, stressed stromal cells can transmit ER to dendritic cells. Finally, miR-17-5p, miR-21-5p and miR-193b-3p associated with ER/UPR can be regulated in decidualized cells. Alterations in these processes are associated with early pathologies, as evidenced in endometrial samples from RPL and RIF patients. |
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| Descripción Física: | 138 p. : il., fotos (algunas color), gráfs. (algunos color), tablas |