FluoTB : una solución rápida y de bajo costo para el diagnóstico de la tuberculosis
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que constituye uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. El agente causal es el bacilo Mycobacterium tuberculosis que se dispersa por vía área. La Organización Mundial de la Salud estima que un 30% de los casos no son diagnosticados, y por...
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| Formato: | Tesis Libro |
| Lenguaje: | Español |
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21 de junio de 2023
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| Sumario: | La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que constituye uno de los mayores problemas sanitarios a nivel mundial. El agente causal es el bacilo Mycobacterium tuberculosis que se dispersa por vía área. La Organización Mundial de la Salud estima que un 30% de los casos no son diagnosticados, y por lo tanto no son tratados correctamente. Existe en la actualidad, la necesidad de nuevos kits de diagnóstico de bajo costo que sean rápidos y fáciles de usar, para ser implementados en países en vías de desarrollo donde la tuberculosis tiene una alta tasa de prevalencia. Los fluoromicobacteriófagos, micobacteriófagos que acarrean genes reporteros fluorescentes en su genoma, se han vuelto una herramienta para revelar el estado metabólico de las micobacterias y, en consecuencia, su respuesta a antibióticos. En trabajos previos del laboratorio se ha descripto el desarrollo de un bacteriófago reportero que porta el gen de la proteína mCherrybomb y permite detectar micobacterias viables por medio de técnicas de fluorescencia, tales como la microscopía o la fluorimetría. Estos fagos han demostrado la capacidad de detectar micobacterias viables y determinar la sensibilidad a rifampicina en muestras clínicas con una alta sensibilidad y especificidad. En este trabajo se optimizaron las condiciones para crear un kit con interés comercial, denominado FluoTB que emplea los fluoromicobacteriófagos para la detección de micobacterias en muestra de esputo de pacientes. El kit se diseñó teniendo en cuenta los requerimientos planteados por la OMS, para proporcionar un producto fácil de usar, que no requiriera mediciones de volumen precisas, que utilizara instrumentos de laboratorio de uso común y que fuera de bajo costo. El protocolo de uso también fue diseñado para incorporarse fácilmente a la rutina del laboratorio diagnóstico, con la menor cantidad de cambios posibles. En este sentido, se trabajó en la optimización de la producción de los fagos a escala industrial, se establecieron los componentes que formarían parte del kit, y las condiciones de estabilidad para su conservación y transporte. Por otro lado se ha visto que, durante la producción de los stock de fagos, se libera una gran cantidad de proteína mCherrybomb en la suspensión que interfiere con los ensayos de fluorimetría. Para resolver este problema, se construyó un fago mutante a partir del fago mCherrybomb original usando la técnica BRED agregando una etiqueta de seis histidinas a la región del gen que da lugar al extremo C-terminal de la proteína mCherrybomb. Fue posible demostrar que esta técnica es útil para remover la proteína libre en suspensión, aumentando la ventana activa en ensayos de fluorimetría. A su vez, se avanzó en la construcción de un bacteriófago defectuoso para la lisis independiente de la temperatura. Se utilizó la técnica de BRED para realizar diferentes mutaciones en el gen gp29, que codifica para la lisina A, con el fin de neutralizar su actividad. Se generaron versiones del bacteriófago con diferentes variantes de LysA y se evaluó su capacidad para generar playas de lisis en un césped de M. smegmatis. Si bien fue posible observar un cambio en la capacidad lítica del fago, las mutaciones introducidas no fueron suficientes para anular la formación de playas de lisis, lo que estaría indicando que existen otros mecanismos implicados en la liberación de la progenie viral. Finalmente y con la intención de en un futuro generar un kit de diagnóstico que se componga de más de un micobacteriófago, se aisló al bacteriófago CELFI, que también es capaz de infectar M. tuberculosis. Luego de aislarlo, se secuenció y se anotó su genoma y se lo caracterizó fenotípicamente. Se vio que este nuevo bacteriófago presenta características llamativas, que lo convierten en bacteriófago con un gran potencial biotecnológico. Tuberculosis is an infectious disease that constitutes one of the biggest health problems worldwide. The causative agent is Mycobacterium tuberculosis, a bacillus that is spread by air. The World Health Organization estimates that 30% of cases are not diagnosed, and therefore are not correctly treated. There is currently a need for new low-cost diagnostic kits that are quick and easy to use, to be implemented in developing countries where tuberculosis has a high prevalence rate. Fluoromycobacteriophages, mycobacteriophages that carry fluorescent reporter genes in their genome, have become a fundamental tool for revealing the metabolic state of mycobacteria and, consequently, their response to antibiotics. Previous laboratory work has described the development of a reporter bacteriophage that carries the gene coding for the mCherrybomb protein that allows the detection of viable mycobacteria by fluorescence techniques, such as microscopy or fluorimetry. These phages have demonstrated the ability to detect viable mycobacteria and determine rifampicin susceptibility in clinical samples with high sensitivity and specificity. In this work, the conditions were optimized to create a kit with commercial interest, named FluoTB, which uses fluoromycobacteriophages for detection of mycobacteria in sputum samples from patients. The kit was designed considering the recommendations from the WHO, to provide a product that is easy to use, does not require precise volume measurements, uses commonly used laboratory instruments, and is low cost. The usage protocol was also designed to be easily incorporated into routine laboratory practices, with as few changes as possible. In this sense, work was done to optimize the production of phages on an industrial scale, the components that would form part of the kit, and the stability conditions for their conservation and transport. On the other hand, it has been seen that, during the production of phage stocks, a large amount of mCherrybomb protein is released into the suspension, which interferes with fluorimetric assays. To solve this problem, a mutant phage was constructed from the original mCherrybomb phage using the BRED technique by adding a six-histidine tag to the region of the gene that gives rise to the C-terminus of the mCherrybomb protein. It was possible to demonstrate that this technique is useful to remove the free protein in suspension, increasing the active window of fluorimetric assays. In turn, progress was made in the construction of a defective bacteriophage for temperature-independent lysis. The BRED technique was used to perform different mutations in the gp29 gene, which codes for lysin A, in order to neutralize its activity. Versions of the bacteriophage with different LysA variants were generated and their ability to generate lytic plaques in a M. smegmatis lawn was evaluated. Although it was possible to observe a change in the lytic capacity of the phage, the introduced mutations were not sufficient to abrogate the formation of lytic plaques, which would indicate that there are other mechanisms involved in the release of the viral progeny. Finally, and with the aim of generating a diagnostic kit that is made up of more than one mycobacteriophage in the future, the CELFI bacteriophage was isolated, which is also capable of infecting M. tuberculosis. After isolation, its genome was sequenced and annotated, and the phage was phenotypically characterized. It was seen that this new bacteriophage presents striking characteristics with great biotechnological potential. |
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| Descripción Física: | 219 p. : il., diagrs., fotos, gráfs., tablas |